Discussione
Un parametro importante in HELM è l’angolo α del fascio rispetto all’asse ottico, che determina la frequenza spaziale di eccitazione u. In Fig. 4, si può vedere che la scelta di u richiede di negoziare la massima frequenza di taglio lungo gli assi kx e ky contro l’anisotropia della banda passante risultante. anisotropia della banda passante risultante.
Il valore scelto (55°) è un buon compromesso e, inoltre, permette l’osservazione diretta del modello di interferenza con obiettivi di immersione.
A causa della banda passante non isotropa, le immagini delle perle mostrano una certa anisotropia e un overshooting vicino ai bordi delle perle; più evidente sono le zone scure nelle direzioni diagonali in Fig. 2A. Questo effetto potrebbe essere evitato in gran parte utilizzando sei o otto raggi laser orientati in multipli di 60° o 45°, rispettivamente.‡
Rispetto al CFM, il rapporto segnale-rumore dell’immagine HELM è superiore, anche se la potenza laser integrata nel tempo era più di 100 volte superiore per l’immagine CFM in Fig. 2C. Una ragione fondamentale per questo miglioramento risiede nel fatto che il miglioramento della risoluzione di CFM rispetto alla microscopia a fluorescenza standard può essere ottenuto solo utilizzando un piccolo foro stenopeico nel percorso della luce di emissione (5, 13, 14). Questa disposizione richiede un compromesso tra il livello di rumore e la risoluzione. Al contrario, in HELM, tutti i fotoni che entrano nelle lenti possono essere raccolti dalla telecamera.
Per gli studi di oggetti dinamici, la velocità di imaging è di grande importanza. La limitazione fondamentale della velocità di imaging nella microscopia a fluorescenza è data dal tasso massimo di emissione dei fluorofori causato dal tempo di vita finito dello stato eccitato (“saturazione del colorante”; rif. 15). In HELM, circa la metà dei fluorofori sono illuminati dal modello di interferenza in una sola volta, mentre nella comune CFM a punto singolo, solo una piccola frazione dei fluorofori è illuminata in una sola volta (≈1 per milione per un’immagine di 1.024 × 1.024 pixel). Di conseguenza, il flusso totale di fotoni dal campione è limitato a valori che sono diversi ordini di grandezza più piccoli per il funzionamento sequenziale di CFM che per quello parallelo di HELM. Poiché un numero minimo di fotoni per immagine è richiesto per un certo livello di segnale-rumore, HELM ha il potenziale di acquisire dati di immagine molto più velocemente di quanto faccia CFM. Oltre a questa considerazione fondamentale, HELM riduce i problemi di velocità legati ai meccanismi meccanici di scansione, perché vengono eseguite solo cinque scansioni per immagine in contrasto con CFM, dove è necessaria una scansione per linea. Sia il problema della saturazione del colorante che le difficoltà di scansione meccanica della CFM, tuttavia, possono essere ridotti dai più recenti scanner multipoint.
I vantaggi nel campo della velocità di imaging possono essere visti anche nei nostri dati sperimentali. Il tempo totale di acquisizione per le cinque immagini richieste per HELM (Fig. 2A) era 1.6 s rispetto a 6.5 s per l’immagine confocale (Fig. 2C). Tenendo conto del più alto rapporto segnale-rumore dell’immagine HELM che si ottiene con un non raffreddato di grado industriale telecamera CCD, la differenza è chiara.
Un punto di interesse pratico è la stabilità richiesta del modello di interferenza durante la misurazione. Abbiamo trovato che errori di offset di fase di 1/10 della spaziatura nodale (20 nm) sono appena tollerabili, ma errori più grandi portano a deterioramenti significativi dell’immagine. La deriva termica del nostro setup (tipicamente 20 nm/min in una stanza a temperatura non controllata) limita il tempo di acquisizione a diverse decine di secondi. Questa limitazione, tuttavia, potrebbe essere facilmente superata ricalibrando gli offset di fase durante una misurazione a lungo termine. L’eterogeneità dell’indice di rifrazione del campione porta anche a errori di fase indesiderati del modello di interferenza, che in questo caso sono dipendenti dallo spazio. Come prima, per limitare questi errori a valori tollerabili, le distorsioni del fronte d’onda introdotte dall’eterogeneità dell’indice di rifrazione non dovrebbero superare alcune decine di nanometri. Ci aspettiamo che i requisiti che si applicano a HELM non differiscono molto da quelli che garantiscono l’imaging ad alta risoluzione con obiettivi ad alta NA ben corretti nella microscopia standard. Ulteriori dati sperimentali saranno necessari per studiare la sensibilità di HELM contro l’eterogeneità dell’indice di rifrazione nella pratica.
Per molte applicazioni, indagare la struttura tridimensionale del campione è di grande interesse. I dati delle immagini tridimensionali possono essere acquisiti facendo passare il fuoco attraverso il campione etichettato (16) o non etichettato (17, 18). Sfortunatamente, la risoluzione assiale per la microscopia a fluorescenza standard è fortemente limitata a circa 0.9 μm per oggetti puntiformi e, ancora peggio, può interrompersi completamente per oggetti arbitrari (19). Questo problema corrisponde al fatto che l’OTF tridimensionale ha un cono mancante intorno all’asse kz all’origine, e di conseguenza, l’immagine tridimensionale risultante mostra potenziali artefatti. La CFM, al contrario, non ha alcun cono mancante e permette l’acquisizione di immagini tridimensionali con una risoluzione assiale di circa 0,8 μm (20), che, tuttavia, è ancora inferiore a quella laterale.
Sono stati descritti diversi metodi per migliorare ulteriormente la risoluzione assiale. Il cosiddetto microscopio 4π (21) è un derivato del CFM con un secondo obiettivo per raccogliere anche i fotoni che si propagano verso il lato posteriore della camera del campione. La risoluzione assiale può teoricamente arrivare a 100 nm, mentre il potere di risoluzione laterale è uguale a quello del CFM. Il microscopio 4π è anche un microscopio a scansione.
Un approccio non a scansione è descritto nei rif. 22 e 23. Una capacità di separazione assiale fortemente aumentata è ottenuta per mezzo di un campo di interferenza che ha i suoi piani nodali e antinodali paralleli al piano dell’immagine. Questo metodo è adatto a oggetti che sono più sottili di un periodo del modello di eccitazione. L’imaging di campioni più spessi può risultare in artefatti, perché la banda passante risultante ha ancora un cono mancante all’origine (9).
Un ulteriore sviluppo che condivide aspetti di quest’ultimo metodo e della microscopia 4π è stato dimostrato recentemente (microscopia I5M; rif. 24). La microscopia I5M impiega un campo di interferenza più complicato generato da una fonte di luce non coerente per illuminare selettivamente il piano dell’oggetto ed è un metodo senza scansione. La risoluzione assiale è uguale a quella della microscopia 4π (100 nm), ma la risoluzione laterale non è affatto aumentata.
Una maggiore risoluzione assiale può anche essere ottenuta illuminando il campione con un modello di frangia prodotto, per esempio, dall’immagine di un reticolo sull’oggetto (25) o dall’interferenza di due raggi laser (26). Per questi metodi, l’algoritmo di ricostruzione applicato differisce significativamente dal nostro, perché il cerchio di trasmissione centrale in Fig. 4 è omesso e perché le informazioni sull’oggetto sono trasferite solo in due bande laterali (27). Si può dimostrare, in questo caso, che la sfocatura fuori fuoco è ridotta.
Desiderabile è un microscopio con una risoluzione uniformemente alta di 100 nm in tutte le direzioni dello spazio senza la necessità di un metodo di scansione. HELM, come stabilito nel nostro attuale setup, non aumenta la risoluzione assiale rispetto alla microscopia a fluorescenza standard. Tuttavia, l’idea chiave è che l’eccitazione armonica, insieme a un algoritmo di ricostruzione simile a quello descritto qui, funziona anche in direzioni spaziali non parallele al piano dell’oggetto. Utilizzando modelli di intensità armonica che hanno i loro piani nodali e antinodali in direzioni spaziali appropriate, si ottengono copie aggiuntive dell’OTF tridimensionale in qualsiasi direzione desiderata. Tali regioni addizionali della banda passante potrebbero essere sovrapposte a una banda passante estesa con un’alta frequenza di taglio in tutto lo spazio reciproco.
La nostra idea per una configurazione futura è di usare unità di deflessione del fascio continuo (come galvanometri o dispositivi acusto-ottici) per produrre facilmente modelli di interferenza in orientamenti selezionati nello spazio e con varie distanze nodali. Una tale configurazione permetterebbe l’imaging tridimensionale e, simultaneamente, risolverebbe i problemi di anisotropia causati dall’OTF bidimensionale a forma di quadrifoglio.