Von Willebrand Factor, ADAMTS13, and Thrombotic Thrombocytopenic Purpura
VWF syntetiseras från en stor gen på kromosom 12p13.31 som omfattar 178 kb och innehåller 52 exoner.49 Det messenger RNA (mRNA) som produceras av denna gen specificerar en polypeptid på 2813 aminosyror, som inkluderar en signalpeptid på 22 aminosyror, en propeptid på 742 aminosyror och en sekvens på 2050 aminosyror som utgör den monomera byggstenen för VWF som finns i plasma. Efter klyvning av signalpeptiden i det endoplasmatiska retikulumet disulfidbinds de monomerer som innehåller propeptid till dimerer genom disulfidbindningar mellan kedjorna som involverar Cys-rester nära molekylens C-terminus. Dessa dimerer transporteras sedan till Golgiapparaten, där propeptiden katalyserar disulfidbindningar mellan dimerer mellan rester i D3-domänen, vilket ger långa multimerer som består av dimerer som är kopplade huvud mot huvud och som innehåller N-terminaler i båda ändar. Propeptiden klyvs sedan av ett furinliknande enzym och det mesta av den resulterande ULVWF förpackas i lagringsgranuler för senare reglerad sekretion.
Bara två celltyper är kända för att syntetisera VWF: endotelceller och megakaryocyter. I endotelceller lagras VWF i granuler som kallas Weibel-Palade-kroppar, i trombocyter lagras det i α-granuler. Det mesta VWF i blodet är av endoteliskt ursprung. Många stimuli kan inducera frisättning av endotelial VWF, inklusive adrenalin, desamino-vasopressin (DDAVP), histamin, trombin, Shigatoxiner och proinflammatoriska cytokiner, inklusive tumörnekrosfaktor (TNF)-α, interleukin (IL)-8 och IL-6 (i komplex med IL-6-receptorn).50 Andra agenser kan också inducera endotelial frisättning av VWF, vilket ger ledtrådar till några av de inciterande faktorerna i TTP. Dessa agenser inkluderar virus som adenovirus51 och oxidanter som superoxid.52 Oxidanter har inte bara förmågan att inducera ULVWF-sekretion; de kan också oxidera VWF så att det inte kan spaltas av ADAMTS1353 och blir mer adhesivt.54 Vidare kan oxidanter, särskilt de som produceras av neutrofiler och monocyter under inflammation, oxidera en avgörande metioninrest i ADAMTS13:s katalytiska domän och inaktivera enzymet.55
Både endotelceller och trombocyter frigör VWF-multimerer som är större än multimerer i normal plasma.56 Dessa ULVWF-multimerer är inte bara mycket större än de som normalt finns i plasma; de är också mycket mer adhesiva och kan binda trombocyternas VWF-receptorglykoprotein Ib (GPIbα; största polypeptid i GPIb-IX-V-komplexet) spontant och med en högre bindningsstyrka än den som uppnås vid bindning av plasma-VWF till GPIbα i närvaro av modulatorerna ristocetin eller botrocetin.57 In vivo innebär detta att ULVWF kan binda trombocyter vid ingen eller låg skjuvspänning, medan bearbetat plasma-VWF kräver hög skjuvspänningsinducerad avveckling för att binda trombocyter.58
En del av nyligen frisatt ULVWF går direkt in i det cirkulerande blodet medan en annan fraktion förblir fäst vid endotelet, där ULVWF-multimerer kan självorganisera sig för att bilda strängar med en längd på flera hundra mikrometer till flera millimeter som förblir förankrade vid endotelytan.59 Ytbundna ULVWF-strängar är hyperadhesiva och binder spontant trombocyter för att bilda trombocyt-dekorerade strängar med ett ”pärlor-på-strängar”-utseende på endotelytan. Under fysiologisk skjuvspänning klyvs de trombocedekorerade ULVWF-strängarna av ADAMTS13 och avlägsnas från endotelytan. Ytterligare bearbetning, som ännu inte är fullständigt karakteriserad, gör att VWF inte kan binda blodplättar spontant. Ackumulationen av trombocytdekorerade ULVWF-strängar på endotelytan till följd av minskade nivåer eller avsaknad av ADAMTS13 i cirkulationen initierar mikrovaskulär trombos, vilket leder till bildning och deponering av trombocytrika hyalina trombier i mikrovaskulaturen – ett karakteristiskt kännetecken för TTP.
ULVWF-strängar består av buntar av VWF-multimerer, och varje sträng är bunden till endotelytan vid flera förankringsställen. I avsaknad (eller i låga koncentrationer) av Ca2+ och Mg2+ fäster ULVWF-strängar vid endotelytan genom att binda till P-selectin.60 I närvaro av fysiologiska koncentrationer av tvåvärda katjoner förankrar ULVWF-strängar till endotelytan genom sin interaktion med integrin αvβ3.61 Andra molekyler är otvivelaktigt involverade i denna förankring av VWF-strängar, men de är ännu oidentifierade.
Förmågan hos VWF- eller ULVWF-multimerer att självassociera sig till tjockare fibrer och kablar blir en viktig mekanism för att reglera VWF:s vidhäftande egenskaper. Savage et al. visade att under skjuvspänning och i närvaro av trombocyter associerar VWF-multimerer i vätskefasen homotypiskt och reversibelt med VWF-multimerer som är immobiliserade på en kollagenyta; de självorganiserade VWF-multimerer stödjer trombocytadhäsion under skjuvspänning62 . VWF-multimerer i vätskefas kan också associera sig med ULVWF-strängar som är fästa på endotelytan,63 och självassociationen underlättas av partiell avveckling av VWF-molekylerna som induceras av skjuvspänning64,65 eller av bindning av ristocetin.66 De självassocierade VWF-molymererna bildar ett nätverk av tvärbundna fibrer på kollagenytor64 eller i lösning.66 Under skjuvspänning kan VWF-molymerer i vätskefas också associera sig med VWF-molymerer som är bundna till trombocyter genom interaktion med GPIbα på trombocyternas yta.67 Självassociering av VWF på trombocytytytor kan utlösa trombocytaktivering, främja trombocytaggregation och öka trombustillväxten.
Förmågan hos VWF att självassociera gör att det kan producera strängar som konkurrerar med eller överträffar längden och tjockleken hos de strängar som produceras genom fibrinpolymerisation. I syntetiska mikrokärl som inducerats att utsöndra VWF genom agoniststimulering kan VWF som utsöndras från kärlväggen samlas till strängar som kan sträcka sig över kärlets lumen, särskilt vid bifurkationer och kurvor68 . VWF:s förmåga att bilda strängar och kablar av sådana enorma dimensioner och att dra dessa kablar tvärs över flödesbanan ökar inte bara chansen att strängarna fångar trombocyter utan ökar också deras förmåga att strimla erytrocyter till schistocyter.
VWWF:s självorganisering i sig själv regleras inte bara av skjuvstress utan också av plasmafaktorer, vilket sannolikt kan förändra förloppet och svårighetsgraden av TTP-episoder. VWF-självassociering dämpas av lipoprotein med hög densitet (HDL) och av apoliprotein (Apo) A-I, den viktigaste proteinkomponenten i HDL. Båda minskar avsevärt längden och tjockleken på VWF-fibrerna som är immobiliserade på endotelytan. Trombocyternas vidhäftning till dessa hyperadhesiva strukturer minskar också i proportion till minskningen av självassocierat VWF. I en modell av TMA hos ADAMTS13-knockoutmöss dämpade HDL också signifikant den trombocytopeni som inducerades av infusion av höga doser humant VWF.69 I överensstämmelse med ApoA-I:s förmåga att modulera VWF-självassociering korrelerar dess plasmakoncentration omvänt med nivån av hyperadhesivt VWF hos patienter med TTP och sepsis. Dessa resultat tyder på att interferens med VWF-självassociering skulle kunna vara ett nytt tillvägagångssätt för att behandla trombotiska sjukdomar som är förknippade med hyperadhesivt VWF, inklusive TTP.
Det VWF-spalande metallproteaset är den 13:e medlemmen i en familj av 18 distinkta enzymer av ADAMTS-typ som hittills har identifierats och som har gemensamma strukturella likheter.16,17 ADAMTS13 består av en N-terminal metalloproteasdomän av reprolysintyp (M), följt av en desintegrindomän (D), en trombospondin-1-liknande domän (T), en cysteinrik domän (C) som innehåller en arginin-glycin-aspartat-sekvens, en spacer-domän (S), ytterligare sju trombospondin-1-liknande domäner (T2-8) och två icke-identiska domäner av CUB-typ (CUB1-2) i den C-terminala änden av molekylen (Fig. 24.2). CUB-domäner innehåller peptidsekvenser som liknar komplementsubkomponenterna C1r/C1s, embryonalt sjöborreprotein egf och benmorfogent protein-1.70 ADAMTS13 är ett Zn2+- och Ca2+-krävande glykoprotein på 190 000 dalton, vars gen finns på kromosom 9q34 och som produceras främst i leverns stellatceller.71,72 ADAMTS13 hämmas av EDTA, varför funktionella analyser av enzymet bäst utförs på citratplasma.12,14-17,73-77 Plasma som antikoagulerats med heparin, klormetylketoner (t.ex. fenylalanin-prolin-aspartatklormetylketon), hirudin och andra direkta trombininhibitorer (DTI) skulle också vara tillfredsställande för testning. Serum som behandlats på lämpligt sätt med proteashämmare är också lämpligt för testning.78
Klyvningen av VWF av ADAMTS13 beror på konformationsförändringar i VWF som orsakas av skjuvspänning, en kraft som ändrar konformationen hos VWF-multimerer från globulär till öppen.79 Denna konformationsövergång följs av att en eller flera A2-domäner inom VWF-multimern vecklas ut, vilket exponerar Tyr1605-Met1606-peptidbindningen för klyvning av ADAMTS1379 eller oxidation av Met1606 med hypoklorit.54 Förutom skjuvkraft underlättas övergången till den tillgängliga konformationen också av förändringar i A2-domänens struktur som orsakas av kolhydratinfästning,80 aminosyrasubstitutioner i typ 2A VWD som destabiliserar A2-domänens veckning,81 och mutationer i typ 2B VWD82 och bindning av ristocetin,83 som båda samtidigt exponerar A1-domänen för trombocyternas bindning och ADAMTS13:s klyvningsställe.
Att känna igen och klyva VWF med hjälp av ADAMTS13 har studerats utförligt. Nya bevis visar att i den ursprungliga ADAMTS13-molekylen är de C-terminala T8-CUB-domänerna i kontakt med de N-terminala MDTCS-domänerna, en intramolekylär interaktion som delvis hämmar MDTCS-domänernas förmåga att binda och klyva VWF-78-peptidsubstratet. I denna nativa konformation är ADAMTS13 delvis autoinhiberad.84,85 ADAMTS13:s förmåga att veckla sig till denna konformation underlättas uppenbarligen av den flexibilitet som ges av fyra förmodade länksekvenser som är belägna mellan T1- och T2-, T2- och T3-, T4- och T5-, T8- och CUB1-domänerna.86 Autoinhiberingen avhjälps när de C-terminala domänerna antingen är trunkerade eller bundna av antikroppar eller multimera VWF, vilket gör det möjligt för MDTCS-domänerna att engagera sig i substratet.
Baserat på mutationsanalyser, bindningsstudier, kinetiska analyser och användning av syntetiska peptidsubstrat har flera interaktionsställen mellan den konformationsmässigt aktiva ADAMTS13 och den ofällda VWF A2-domänen identifierats och sammanfattats i en molekylär blixtlås-modell87 , vilket visas schematiskt i fig. 24.3. När multimera VWF utsätts för en kritisk nivå av skjuvspänning exponeras först en exosit i A2-domänen. Denna exosit omfattar den spiralformade regionen Glu1660-Arg1668 som är 65 aminosyror C-terminal till klyvningsstället och binder till ADAMTS13:s spacer-domän med hög affinitet (KD ~ 10 nM).88-90 Skjuvspänning exponerar också en andra exosit med låg affinitet i A2-domänen vid eller i närheten av Asp1614 (P9′-stället), som interagerar med Arg349 i ADAMTS13:s desintegrindomän.91 Interaktionen mellan dessa två exositer och komplementära regioner i ADAMTS13 placerar klyvningsstället Tyr1605-Met1606 i VWF med det aktiva centret i ADAMTS13:s metalloproteasdomän. Detta inbegriper interaktion mellan Leu1603 (P3-plats) i VWF och kompletterande Leu198, Leu232 och L272 (S3-plats) i ADAMTS13, Tyr1605 (P1-plats) i VWF med Leu151 och Val195 (S1-plats) i ADAMTS13, och Met1606 (P1′-plats) i VWF med Asp252-Pro256 (S1′-plats) i ADAMTS13.92 Phage display och slumpmässig mutationsanalys bekräftar och visar att aminosyror i P3-P2′- och P11′-regionen (Ile1616) också är viktiga för klyvningen93. Således underlättar sekventiell interaktion mellan dessa komplementära regioner i de två multidomänproteinerna specifik klyvning av den scissila bindningen.
Sviktande nedbrytning av ULVWF-multimerer har länge misstänkts orsaka familjära och förvärvade idiopatiska typer av TTP, eller predisponera en individ för dessa störningar (Fig. 24.4).11,94 Kritiska experiment som utfördes för att verifiera detta koncept rapporterades 1997 och 1998. Fyra patienter med kronisk recidiverande TTP visade sig ha brist på ADAMTS13-aktivitet i plasma.12 Eftersom ingen hämmare av enzymet påträffades, tillskrevs denna brist en abnormitet i produktionen, överlevnaden eller funktionen av proteaset. Under det följande året klarlades patogenesen för den vanligare förvärvade idiopatiska typen av TTP.13-15 Patienter med förvärvad idiopatisk TTP hade liten eller ingen plasma-ADAMTS13-aktivitet under akuta episoder, men denna aktivitet ökade mot det normala vid återhämtning. Även om plasmaanalyserna i dessa studier inte var fysiologiska var de ändå innovativa och informativa. Immunoglobulin (Ig) G autoantikroppar mot enzymet förklarade troligen bristen på proteasaktivitet hos de flesta patienter med förvärvad idiopatisk TTP.13-15 Orsakerna till denna övergående immundysreglering, liksom till den selektiva antigena inriktningen av det VWF-spalande proteaset, är ännu inte kända.
Patienter med familjär kronisk relapserande TTP har ofta ULVWF-multimerer i sin plasma.11,94 ULVWF multimerer påvisas med hjälp av en känslig agarosgelelektroforesemetod i vissa patientplasmaprover under akuta episoder av förvärvad idiopatisk TTP, men inte efter återhämtning94 . Dessa fynd förklarades av forskare som upptäckte en kronisk avsaknad av ADAMTS13 i plasma vid familjär kronisk relapserande TTP, samt en övergående hämning av enzymet under akuta episoder av förvärvad idiopatisk TTP.12-15
De flesta patienter med familjär TTP har mindre än 5 % av den normala ADAMTS13-aktiviteten i sin plasma, oavsett om plasman erhålls under eller efter akuta episoder (under förutsättning att de inte nyligen har fått plasmainfusioner). De flesta patienter med förvärvad idiopatisk TTP har mindre än 5 % av normal ADAMTS13-aktivitet i sin plasma endast under akuta TTP-episoder12 .-15,24,95 En allvarlig brist på ADAMTS13-aktivitet i plasma från patienter med TTP korrelerar med en oförmåga att klyva ULVWF-multimerer när de kommer ut från endotelcellernas ytor (se fig. 24.4).59 Som en följd av detta förblir ULVWF-multimerer som utsöndras av endotelcellerna förankrade vid dessa celler och självassocierar sig till långa strängar59 och kan fånga upp passerande trombocyter genom att binda trombocytens GPIbα (fig. 24.5).68 (Trombocyter binder inte spontant till de mindre VWF-formerna som cirkulerar efter klyvning av ULVWF-multimerer.)56 Ytterligare trombocyter ansluter sig därefter till det växande trombocytaggregatet (rekryteras till aggregatet via aktiverat αIIbβ3), som kan växa till den punkt där kärlet ockluderas (se fig. 24.4).59,96 Även om de flesta fall av idiopatisk TTP uppvisar allvarlig ADAMTS13-brist, finns det en undergrupp som inte har allvarlig brist på enzymaktivitet enligt de tester som för närvarande finns tillgängliga.97 Det är ännu inte klart om detta beror på interferens med enzymaktiviteten från antikroppar som inte upptäcks av de tillgängliga testerna, VWF:s motståndskraft mot klyvning (t.ex. på grund av oxidativ modifiering),53 eller på andra orsaker. Trots detta är det troligt att många patienter i denna kategori fortfarande kommer att ha nytta av plasmautbytesbehandling.98 Det bör också betonas att ADAMTS13-brist varken är känslig eller specifik (ADAMTS13-aktiviteten är minskad vid många andra sjukdomar)99 för att ställa diagnosen förvärvad TTP.
ULVWF-strängar kan lossna från endotelcellerna i avsaknad av ADAMTS13-aktivitet, och blir mekaniskt avklippta med den ökande spänning som genereras av vätskans skjuvspänning när trombocyter fäster och aggregerar.59 De lossnade ULVWF-plättarsträngarna kan ockludera nedströms liggande mikrokärl och bidra till ischemi i organet.
Plasma ADAMTS13-aktivitet saknas nästan alltid eller är kraftigt nedsatt hos patienter med familjär TTP,12,100,101 till följd av homozygota eller sammansatta heterozygota mutationer i ADAMTS13-genen.18,24,95,102,103 Mutationer vid familjär TTP har upptäckts i hela genen i regioner som kodar för olika domäner (se figur 24.2). Vid allvarlig medfödd brist på ADAMTS13-aktivitet börjar episoder av TTP vanligen under spädbarns- eller barndomen. Hos vissa patienter utvecklas dock inte uppenbara TTP-episoder förrän efter flera år (t.ex. under en första graviditet),102 om ens någonsin. Den sistnämnda observationen tyder på att det hos vissa patienter finns kvarstående aktivitet av ADAMTS13 och att akuta episoder av TTP utlöses när frisättningen av ULVWF från endotelceller överskrider den begränsade kapaciteten hos deras ADAMTS13 att bearbeta dem. Ett fall där detta kan ske med regelbundenhet är under graviditet: Det är känt att VWF-nivåerna ökar under dräktigheten.104-106 I överensstämmelse med denna föreställning diagnostiseras kvinnor med medfödd TTP ofta under sin första graviditet.29 Hos spädbarn med neonatal debut av medfödd TTP och mindre än 5 % ADAMTS13-aktivitet är övergående eller progressiv njursvikt ofta en framträdande komponent i sjukdomen.107 Dessa patienter liknar kliniskt två patienter som beskrevs 1960 av Schulman och medarbetare108 och 1978 av Upshaw109; därför kallas denna pediatriska undergrupp ibland för att ha ”Upshaw-Schulman-syndromet”.
För många patienter med förvärvad TTP är ADAMTS13-aktiviteten i plasma antingen obefintlig eller kraftigt reducerad under akuta episoder, och den ökar när de återhämtar sig, oavsett om det rör sig om enstaka eller återkommande episoder.13-15 IgG-autoantikroppar som hämmar ADAMTS13-aktiviteten i plasma kan påvisas hos 44 % till 94 % av dessa patienter.13-15,102,110,111 Dessa resultat tyder på förekomsten av en övergående eller intermittent återkommande defekt i immunregleringen hos många patienter som har förvärvad idiopatisk TTP associerad med ADAMTS13-brist. Antikroppar som hämmar ADAMTS13 i plasma har också identifierats hos några få patienter med ticlopidin- eller klopidogrelassocierad TTP.34,112 Det är ännu inte känt om en övergående allvarlig defekt i ADAMTS13-produktion eller överlevnad förekommer hos patienter med förvärvad TTP som inte har påvisbara autoantikroppar mot enzymet. Alternativt kan misslyckandet med att påvisa hämmande autoantikroppar hos vissa patienter återspegla den begränsade känsligheten hos de testsystem som för närvarande används. Icke-hämmande autoantikroppar som kan binda och potentiellt förmedla immunclearance av ADAMTS13 upptäcks inte av det nuvarande testsystemet.
En studie utvärderade ADAMTS13-epitoper som erkändes av polyklonala autoantikroppar hos 25 patienter med förvärvad TTP,113 och konstaterade att antikroppsmålen undantagslöst inkluderade sekvensen cysteinrik/spacerdomän (CS); hos tre patienter var detta den enda region som antikropparna riktade in sig på. De övriga 22 autoantikropparna reagerade med CS-domänsekvensen plus CUB-domänerna (64 %), metalloproteas/disintegrinliknande/första trombospondin-1-liknande domänen (MDT) (56 %) eller den region som innehåller de andra till åttonde trombospondin-1-liknande upprepningarna (T2-8, 28 %) (se fig. 24.2). Propeptidregionen identifierades också av 20 % av autoantikropparna,113 vilket tyder på att avlägsnande av propeptiden inte krävs för sekretion av aktivt enzym.114 Autoantikroppar hämmar aktiviteten hos ADAMTS13 eller minskar dess överlevnad. I en annan studie av sju patienter identifierade Luken et al.115 ADAMTS13-autoantikroppar hos sex patienter som enbart band till spacerdomänen (S); hos den sjunde patienten band antikropparna till både S-domänen och T2-8-repeaten. Genom mutagenes fastställde dessa forskare att regionerna Thr572-Asn579 och Val657-Gly666 i ADAMTS13:s spacerdomän var de gemensamma epitopen för bindning av autoantikroppar116. När Arg660, Tyr661 eller Tyr665 ersattes med alanin eliminerades bindningen av autoantikropparna från de sex TTP-patienterna.117
Autoantikroppar mot ADAMTS13 hos patienter med förvärvad TTP tillhör främst IgG-klassen,118 även om IgM- och IgA-klassantikroppar också har upptäckts.119 Kloning och sekvensering av de monoklonala antikropparna från patienter med förvärvad TTP visar att det finns en preferentiell inkorporering av den tunga kedjans gensegment VH1-69 i den variabla regionen hos immunglobulinerna.120,121 Denna preferens antyder att CDR2- eller CDR3-regionen i VH1-69 kan bidra till specificiteten för en epitop på spacer-domänen hos ADAMTS13. I en analys av fördelningen av antikroppssubtyper hos 58 patienter med akut förvärvad TTP påvisades antikroppar som tillhörde alla IgG-subtyper.118 IgG4 var den vanligaste subtypen och förekom hos 90 % av patienterna, antingen ensamt eller i kombination med andra IgG-subtyper.
Produktionen av ADAMTS13-autoantikroppar är med största sannolikhet genetiskt påverkad. Detta faktum betonas av upptäckten hos tvillingsystrar av förvärvad TTP orsakad av ADAMTS13-autoantikroppar.122 Återfall förekommer hos 23-44 % av patienterna med förvärvad TTP,102,110,123,124 ofta under det första året efter den första episoden.102 Återfall är vanligast bland patienter med de lägsta ADAMTS13-aktivitetsnivåerna (<10 %).
Graviditet och postpartum utgör en särskild utmaning när det gäller TTP. För det första har preeklampsi och HELLP-syndromet (hemolys, förhöjda leverenzymer, låga trombocyter) många kliniska drag som överlappar med TTP och kan dela vissa patofysiologiska drag som systemisk endoteldysfunktion och proteinuri (se kapitel 32).125 HELLP-syndromet kan vara särskilt svårt att skilja från TTP eftersom det också uppvisar mikroangiopatisk hemolytisk anemi, förhöjda LDH-nivåer och trombocytopeni (även om den vanligtvis inte är lika allvarlig som vid TTP).126 TTP under graviditet kan vara förknippat med autoantikroppar mot ADAMTS13, och sjukdomen manifesterar sig vanligen nära terminen eller postpartum.127 Uppskattningar av risken för återfall under efterföljande graviditeter varierar kraftigt, från 26 % till 73 % per graviditet.102
Aktiviteten av ADAMTS13 i plasma hos friska vuxna varierar från cirka 50 % till 178 % av normal poolad plasma med hjälp av för närvarande tillgängliga statiska analyser. Minskad ADAMTS13-aktivitet har också påträffats vid leversjukdom, spridda maligniteter,128 systemiska inflammatoriska syndrom såsom de som orsakas av endotoxin,129 akut pankreatit,130 svår sepsis och septisk chock,131 sepsisinducerad DIC,132 och sepsisinducerad organdysfunktion.133-135 Dessutom kan låga ADAMTS13-nivåer påträffas under graviditet och hos nyfödda barn.136 Med undantag för de peripartumkvinnor som utvecklar öppen TTP,102,110 är ADAMTS13-aktiviteten som observeras hos patienter med dessa tillstånd inte reducerad till de extremt låga värden (<5 % av normalvärdet) som finns hos de flesta patienter med familjär eller förvärvad TTP.
ADAMTS13-analyser
ADAMTS13-analyser bestämmer proteolytisk aktivitet, antigennivå och nivå av anti-ADAMTS13-autoantikroppar. Tidiga ADAMTS13-aktivitetsanalyser baserades på nedbrytning av renade VWF-multimerer i närvaro av denatureringsmedel och kvantifiering av klyvningsprodukterna genom immunoblotting,74,75 kvarvarande kollagenbindning,137 eller minskad ristocetininducerad trombocytaggregation.138 Även om dessa analyser är känsliga är de besvärliga och tidskrävande att utföra och innebär användning av denatureringsmedel. Dessa tester ersattes efter att studier av rekombinanta VWF-fragment avslöjade minimala sekvenser som är nödvändiga för aktivitetsmätningar. Kokame och medarbetare utförde partiella deletioner av VWF A2-domänen och identifierade en minimal peptid på 73 aminosyror (VWF73, Asp1596-Arg1668) som effektivt klyvdes av ADAMTS13 i frånvaro av denatureringsmedel under statiska förhållanden88 . Därefter har flera tester baserade på klyvning av peptider som omfattar VWF73 utvecklats, t.ex. fluorescensresonansenergiöverföring (FRET)97 , ett HRP-bundet VWF78139 , ELISA140 , immunoblotting141 och masspektrometri142 .
Under 2008 genomfördes en andra internationell samarbetsstudie för att jämföra prestandan hos åtta funktionella och tre antigenanalyser för ADAMTS13.143 Jämförelsen av dessa metoder visade att klyvningsanalyser baserade på modifierade VWF-peptider som substrat erbjöd hög noggrannhet och reproducerbarhet och låg varians och variabilitet mellan metoderna. FRET-VWF73-analysen har sedan dess använts i stor utsträckning för att kvantifiera ADAMTS13-aktiviteten i patientprover. Även om den FRET-baserade analysen är lätt att utföra har den flera begränsningar. För det första bör FRET-VWF73-klyvning med citratplasma som källa för ADAMTS13 utföras vid lägre temperaturer än 33 °C, eftersom betydande irreversibel inaktivering av ADAMTS13 genom citratmedierad kalciumkelation sker vid 37 °C. För det andra kräver optimal fluorescenssignaldetektion att FRET-VWF73-substratet klyvs vid pH 6,1, vilket minskar klyvningshastigheten. För det tredje bildar vissa inhiberande autoantikroppar inte stabila komplex med ADAMTS13 vid detta suboptimala pH, och dessa antikroppar förblir oupptäckta i inhibitionsstudier. För det fjärde förekommer betydande interferens av fluorescenssignalen från hemoglobin och bilirubin på grund av spektral överlappning. Ett förbättrat FRET-baserat peptidsubstrat, FRETS-rVWF71, har utvecklats. ADAMTS13-aktiviteten i serum och citrerad eller hepariniserad plasma kan mätas med detta förbättrade substrat vid fysiologiskt pH, jonstyrka och kalciumkoncentration, utan interferens från endogena VWF-multimerer eller bilirubin eller hemoglobin i plasma.78 En annan begränsning för dessa peptidbaserade aktivitetsanalyser är att ADAMTS13:s förmåga att klyva multimer VWF under skjuvspänning inte bedöms. Även om den skjuvspänning som produceras av konstant vortexning har visat sig främja klyvningen av VWF-multimerer,144 är kvantifiering av klyvningsprodukterna genom immunoblotting fortfarande tidskrävande. Minst fyra kommersiella kit finns tillgängliga för mätning av ADAMTS13-aktivitet baserat på rapporterade metoder. Dessa kit har dock inte utvärderats i direkta jämförelser och standardiseringsstudier.
ADAMTS13-antigennivåer har kvantifierats med monoklonala och polyklonala antikroppar.145,146 Inverkan av trunkering, mutationer och autoantikroppar på noggrannheten och känsligheten hos dessa tester är inte klarlagd. Fem kommersiella testkit finns tillgängliga för att mäta ADAMTS13-antigennivåer, men ingen validering och jämförelse med andra tester har utförts.
Under 2015 fastställdes den första internationella standarden för ADAMTS13 och testades i 32 laboratorier från 14 länder för ADAMTS13-aktivitet och antigennivåer jämfört med lokala standarder.147 Denna plasmastandard, benämnd WHO IS (12/252), härstammade från poolad plasma från 38 normala friska givare. Denna studie visade ett konsensusmedelvärde på 0,91 enheter/mL ADAMTS13-aktivitet för denna plasma med en interlaboratorievariabilitet på 12,4 % och 0,92 enheter/mL ADAMTS13-antigen med en interlaboratorievariabilitet på 16,3 %. Den stora variabiliteten mellan laboratorierna berodde inte i första hand på användningen av olika lokala standarder utan på metodologiska skillnader mellan laboratorierna.
Tester av anti-ADAMTS13-autoantikroppar utförs vanligen genom att man blandar värmeinaktiverad patientplasma med en känd mängd poolad normal plasma och mäter resterande ADAMTS13-aktivitet. Icke-neutraliserande antikroppar påvisas genom immunoblotting.148
Och även om ingen icke antikroppsspecifik ADAMTS13-hämmare hittills har identifierats kan flera proteiner och peptider hämma ADAMTS13-klyvningen av VWF under särskilda förhållanden. Dessa inkluderar hemoglobin, IL-6, trombospondin-1 och neutrofila α-defensiner. I samtliga fall binder de hämmande ämnena uppenbarligen substratet, VWF, och förhindrar att VWF klyvs av ADAMTS13. Hemoglobin har visat sig fungera på detta sätt och binder VWF-strängar på endotelytan under flödet och blockerar kompetitivt klyvningen av ADAMTS13.149 Denna mekanism kan bidra till de vaso-okclusiva komplikationerna hos patienter med sicklecellanemi med betydande hemolys och ytterligare komplicera TTP när hemolysfrekvensen är hög. Höga koncentrationer av IL-6 (50 och 100 ng/ml) hämmar också den ADAMTS13-medierade klyvningen av endoteliala ULVWF-strängar under flöde in vitro,50 vilket tyder på att denna mekanism kan bidra till trombos under cytokinstorm150 eller cytokinfrisättningssyndromet.151 Trombospondin-1, ett rikligt förekommande protein i trombocyternas α-granuler som släpps ut i cirkulationen vid trombocytaktivering, binder till VWF:s A2-A3-regioner och blockerar och hämmar konkurrensmässigt klyvningen av ADAMTS13 in vitro.152 Denna protrombotiska egenskap hos trombospondin-1 stämmer överens med defekt trombocytrekrytering till aktiverat eller skadat endotel och ökad embolisering av trombocyttrombos som observerats hos trombospondin-1 knockoutmöss.153 Humana neutrofila peptider kända som α-defensiner, som frigörs från aktiverade neutrofiler, kan binda VWF:s A2-domän och kompetitivt blockera ADAMTS13-medierad klyvning.154 Koncentrationerna av α-defensiner ökar upp till sju gånger i plasma hos patienter med förvärvad TTP.