Alai

Sammanfattning

Bakgrund: Syftet var att utvärdera incidensen, konsekvenserna och den förebyggande strategin för anti-D alloimmuniseringar hos bärare av D-varianter i den obstetriska populationen i Split-Dalmatia County, Kroatien. Metoder: RhD-immuniseringshändelser utvärderades retrospektivt för perioden mellan 1993 och 2012. Kvinnor testades för RhD-antigen och irreguljära antikroppar. De med anti-D-antikroppar som inte var serologiskt D- genotypades för RHD. De utvärderades med avseende på deras obstetriska och transfusionshistoria och deras anti-D-titer. De nyfödda utvärderades med avseende på RhD-status, direkt antiglobulintest (DAT), hemoglobin- och bilirubinnivåer, transfusionsterapi samt fototerapi och resultat. Resultat: Av 104 884 levande födda barn testades 102 982 kvinnor för RhD-antigen. Anti-D-immunisering förekom hos 184 kvinnor, vilket motsvarar 0,9 % av individerna med risk för anti-D-bildning. 181 fall inträffade hos kvinnor som serologiskt typats som D-. Tre kvinnor var partiella D-bärare (DVa n = 2, DNB n = 1), ursprungligen typade RhD+, och erkändes som D-variantbärare efter att immunisering skett. Anti-D-titern varierade från 1:1 till 1:16. Sex barn var RhD+, fyra hade positiv DAT och två genomgick fototerapi. Slutsats: Anti-D-immunisering förekom hos gravida partiella D-bärare (DVa, DNB). RhD+ barn hade serologiska markörer för hemolytisk sjukdom hos fostret och det nyfödda barnet (HDFN), utan några fall av allvarlig HDFN.

© 2016 S. Karger GmbH, Freiburg

Introduktion

RhD-antigenet är ett mycket immunogent antigen som är betydelsefullt för förlossningsmedicinen på grund av anti-D:s förmåga att orsaka hemolytisk sjukdom hos fostret och det nyfödda barnet (HDFN) . Förutom det vanliga D+ kan D-antigenet presenteras i mer än 200 varianter som för närvarande är kända som D-varianter . Minskat uttryck av D-antigenet kallas traditionellt för ”svag D”, medan ”partiell D” representerar varianter där mutationer och genomföringar resulterar i en förändrad proteinsekvens som saknar vissa polypeptider på den yttre RBC-ytan , även om det har bevisats att distinktionen mellan svag och partiell D är flytande och att svaga D-typer har något till avsevärt förändrade D-antigener . De flesta svaga D-varianter hos kaukasier omfattar svaga D typ 1, typ 2 och typ 3, som inte är kända för att bilda alloanti-D . Omvänt är partiella D-bärare benägna att bilda anti-D. DVI-kategorin är den mest kliniskt relevanta partiella D bland kaukasier och är den D-variant som oftast rapporteras vara inblandad i anti-D-immunisering samt HDFN . HDFN hos spädbarn från delvis D-mödrar med anti-D har dokumenterats, men i de flesta fall hade det varit lindrigt, med sällsynta undantag .

Den låga risken för RhD-immunisering hos kvinnor med svaga D-typerna 1, 2 och 3 är anledningen till att de flesta författare anser att kvinnor med utbredda svaga D-typer inte behöver RhD-immunprofylax , och att svaga D-patienter säkert kan få D+ RBC-enheter . Omvänt bör kvinnor med partiell D klassificeras som D- med tanke på deras prenatala behandling och RhD-immunprofylax . I Europa väljs anti-D-reagens ut för att medvetet klassificera gravida DVI-bärare som D- för att se till att dessa mödrar får RhD-immunprofylax under den andra trimestern och/eller efter förlossningen. Distributionen av D-varianter varierar mellan olika populationer, och deras erkännande beror på valet av D-typningsreagens som används .

Vi utvärderade retrospektivt fallen av RhD-alloimmunisering och RhD-antigen hos gravida kvinnor under en period av 20 år. För kvinnor som inte var serologiskt D- analyserade vi orsaken till immunisering (transfusion eller graviditet), deras serologiska reaktivitet och RHD-genotyp. Vi fastställde också om det hade förekommit fall av HDFN bland barn till RhD-alloimmuniserade mödrar med D-variant. Syftet med studien var att utvärdera förekomsten och konsekvenserna av anti-D alloimmuniseringar hos bärare av D-varianter i den obstetriska populationen i länet Split-Dalmatien.

Material och metoder

Denna studie utfördes på avdelningen för transfusionsmedicin vid sjukhuscentret vid universitetet i Split, i länet Split-Dalmatien, Kroatien. Split-Dalmatien län har cirka 5 000 födslar per år. Sjukhuset är en regional institution som ansvarar för den övergripande graviditetsvården, övervakning av RBC-alloimmuniserade kvinnor och hantering av förlossningar. Alla gravida kvinnor i denna region typades för ABO- och RhD-antigener och testades för oregelbundna antikroppar vid det första besöket. Vid varje efterföljande besök utfördes endast kontroll av indirekt antiglobulintest (IAT). RhD-immunprofylax ges rutinmässigt till RhD-kvinnor efter förlossning av RhD+-barn. Kvinnor med D-variant behandlades som RhD-kvinnor om transfusionsterapi krävdes, men de fick ingen RhD-immunprofylax. Om RHD-genotypning avslöjade partiellt D-antigen administrerades immunprofylaxen efter RhD+-barnets födelse.

Graviditeter med D-variant och Anti-D

Vi utvärderade retrospektivt RhD-immuniseringshändelser i den obstetriska populationen för perioden 1 januari 1993 till 31 december 2012. I Split-Dalmatiens län registrerades 104 884 levande födslar mellan den 1 januari 1993 och den 31 december 2012. Under denna period testades 102 982 graviditeter för ABO- och RhD-antigen och för irreguljära antikroppar på vår avdelning (98 % screeningtäckning, vilket stämmer överens med en tidigare studie av vår obstetriska population) . Antalet RhD-typningstester och antalet serologiskt erkända D-varianter samlades in från det manuellt skrivna protokollet för tester av förlossningspatienter för perioden mellan 1993 och 2001 och från datadatabasen för perioden mellan 2002 och 2012.

Under denna period använde vi vaccinationsuppföljningsblanketter för uppföljning av graviditeter med anti-D-alloantikroppar, som fylldes i efter det att kliniskt relevanta alloantikroppar hade påvisats. Från dessa formulär analyserade vi det totala antalet gravida kvinnor med RhD-immunisering, med detaljerad analys av RhD-immuniserade kvinnor som inte var serologiskt RhD-. För dessa kvinnor analyserade vi immuniseringshändelser som kan orsaka RhD-immunisering, tidigare graviditeter, tidigare transfusioner och RhD-immunprofylaxadministration postpartum; dessutom analyserade vi RHD-genotypen hos kvinnor med D-variant. Under graviditeten mättes titern av anti-D-antikroppar med 2-4 veckors mellanrum, och resultaten för varje mätning antecknades i immuniseringsuppföljningsblanketter. Formulären innehöll också uppgifter om spädbarnens RhD-status och direkt antiglobulintest (DAT).

Data om RhD+ barn från D-variantkvinnor med anti-D-antikroppar samlades in från patienternas anamnes på avdelningen för pediatrik och neonatologi. Den insamlade informationen omfattade uppgifter om HDFN, neonatala hemoglobin- och bilirubinnivåer, neonatal transfusionsterapi och fototerapi samt andra neonatala resultat.

Serologisk typning av RhD-antigen

Under perioden från den 1 januari 1993 till den 10 april 2008 utfördes rutinmässig RhD-typning med hjälp av direkt agglutination i rörtest med två av följande monoklonala reagenser: Anti-D M MonoGnost® (MS-201; BioGnost, Zagreb, Kroatien), NovaClone® Anti-D IgM+IgG Monoclonal Blend (CI 175-2, D415, 1E4, Immucor Gamma, Dartmouth, NS, Kanada), Anti-D MG MonoGnost® (RUM-1 IgM, MS-26 IgG, BioGnost).

Om RhD-antigenet typades negativt vid direkt agglutination typades det vid IAT. RhD-antigen som var negativt vid direkt agglutination men positivt vid IAT klassificerades som ”D-variant”. Testning av RhD-antigen i IAT med hjälp av kolonnmetoden utfördes med hjälp av Anti-D BioClone® human monoklonal-polyklonal blandning (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA).

Från den 10 april 2008 till den 31 december 2012 utfördes RhD-typning i direkt agglutination med automatiserad mikrokolonnteknik med hjälp av ABO-DD Grouping Cassette (Ortho Clinical Diagnostics) som innehåller två monoklonala IgM anti-D-reagenser (klon D7B8 och klon RUM-1). Testning av RhD-antigen i IAT har utelämnats efter införandet av mikrokolonnteknik. De fall med avvikande serologiska resultat skickades för molekylär RHD-analys, och immunprofylax genomfördes för kvinnor som visade sig vara partiella D-bärare.

RHD-genotypning

DNA-extraktion från EDTA-blodprover gjordes manuellt med QIAamp DNA Blood Mini kit® (Qiaqen, Hilden, Tyskland) eller med Qiacube-analysator® (Qiaqen). Molekylär typning av D-varianter utfördes med PCR-SSP-kit (Ready GeneWeak D® och Ready GeneCDE®; Inno-Train, Kronberg im Taunus, Tyskland) enligt tillverkarens anvisningar.

Resultat

Under den observerade perioden av 102 982 graviditeter som testades för ABO- och RhD-antigener och irreguljära antikroppar hade 184 gravida kvinnor drabbats av RhD-alloimmunisering hos 20 050 kvinnor som var RhD- eller D-varianter. Det motsvarar 0,9 % av de gravida kvinnor som löper risk att drabbas av RhD alloimmunisering. Av dessa var 181 kvinnor serologiskt typade RhD-, och 3 immuniseringar (1,63 % av anti-D-immuniseringarna) inträffade hos kvinnor som var bärare av RhD-varianter. RHD-genotypning definierade att 2 av 3 kvinnor var bärare av partiell D-typ Va, medan 1 kvinna var bärare av partiell D-typ DNB (fig. 1). Alla 3 kvinnorna märktes som RhD+ i sin första serologiska typning av RhD-antigen, på grund av valet av reagenser som användes vid den tidpunkten (Anti-D M MonoGnost, NovaClone Anti-D IgM+IgG Monoclonal Blend. Därför fick två av tre RhD+ RBC, och ingen av dem fick antenatal eller postnatal anti-D-immunprofylax. Egenskaperna hos den partiella D-kvinnan med anti-D-immunisering visas i tabell 1. En av dem (DVa) immuniserades uteslutande på grund av graviditeten, medan immuniseringen för de andra 2 kvinnorna (DVa och DNB) sannolikt var en följd av att de transfunderades med RhD+ RBC (tabell 1).

Under studieperioden typades 484 kvinnor som D-variant (Du) med hjälp av enbart serologiska typningsmetoder. Dessa kvinnor fick ingen immunprofylax, men de fick D- RBC-enheter vid transfusioner (fig. 1). Det fanns inga fall av anti-D-bildning bland dem.

Tabell 2 visar uppgifter om anti-D-titer hos de immuniserade mödrarna samt uppgifter om deras drabbade barn, inklusive neonatal DAT, hemoglobin, bilirubin, fototerapi och transfusionsterapi.

Den DNB-varianterade kvinnan visade sig vara immuniserad under utredningen av det nyfödda barnets positiva DAT. Eftersom kvinnan var medborgare i Bosnien och Hercegovina och hade anlänt till Kroatien strax före förlossningen fanns det inga uppgifter om hennes tidigare immunohematologiska tester. Med hjälp av information om hennes hälsohistoria kunde vi dock konstatera att hon hade fått A+ RBC efter föregående barns förlossning. Det nyfödda barnet behövde endast fototerapi. Hennes efterföljande graviditet resulterade i att hon födde ett barn vars DAT-värde var starkt positivt och barnet behövde en kompletterande transfusion under sin åttonde levnadsdag. Transfusionen tillskrevs dock inte hemolys utan till kirurgi på grund av det inkarcererade bråcket.

Den andra kvinnan (partiell D-typ Va) visade sig vara alloimmuniserad vid hennes upprepade rutinscreening för irreguljära antikroppar i den 34:e veckan av hennes andra graviditet. Hennes transfusionshistoria var negativ. Trots att hon bar på ett RhD+ barn förblev hennes anti-D titer mycket låg under hela graviditeten. Det nyfödda barnets DAT-prov efter förlossningen var negativt, och bilirubin- och hemoglobinnivåerna låg inom referensområdena. Hennes andra RhD+ barn hade dock patologiskt höga bilirubinnivåer och krävde fototerapi.

Den tredje kvinnan (partiell D-typ Va) visade sig vara alloimmuniserad vid den rutinmässiga blodgruppsbestämningen och screeningen i den andra graviditeten, hennes första graviditet var händelselös men följdes av en transfusion av två enheter av A+ RhD+ RBC. Trots att två av hennes fyra efterföljande graviditeter resulterade i att RhD+ barn föddes vars DAT var 1+ positiv och att hon hade den högsta anti-D-titern av alla tre kvinnor, upptäcktes inga patologiskt höga bilirubinnivåer, synlig gulsot eller anemi hos något av hennes barn, deras postnatala perioder var händelselösa och de skrevs ut från sjukhuset utan komplikationer. Sammantaget hade kvinnorna med partiella D-varianter och anti-D-immunisering sammanlagt sex graviditeter med RhD+ barn. Två spädbarn behövde fototerapi, men det hade inte förekommit några fall av allvarlig HDFN.

Diskussion

Denna studie analyserar RhD-vaccinationer hos gravida kvinnor som var bärare av D-varianter, i Split-Dalmatiens län. Vi hittade 184 gravida kvinnor med anti-D-antikroppar, vilket utgör 0,9 % av individerna med risk för anti-D-bildning. Detta stämmer överens med ett nyligen utfört arbete om vår förlossningspopulation med anti-D . En så hög procentsats tillskrivs det faktum att profylax under förlossningen inte genomförs i vårt land, och behovet av att det ska bli standardpraxis har redan betonats . 181 alloimuniserade kvinnor fick en serologisk typ som RhD-. Tre alloimmuniserade personer som ursprungligen typades som RhD+ var delvis D-bärare. Det fanns inga fall av anti-D-bildning bland gravida kvinnor som ursprungligen erkändes som D-variant och tilldelades ”Du”-status.

I vissa länders riktlinjer för förebyggande av anti-D alloimmunisering anges att svaga D- eller Du-kvinnor inte behöver profylax, medan nyare rekommendationer betonar vikten av att lösa oklara RhD-typningsresultat , och behandla alla D-varianter utom svaga D-typerna 1, 2 och 3 som D- .

Till och med 2008 baserades RhD-antigentestning vid vårt center endast på serologi. Kvinnor som befanns vara RhD- med hjälp av rörmetoden genom direkt agglutination men RhD+ vid indirekt agglutination tilldelades D-variant eller Du och fick ingen RhD-immunprofylax; de betraktades dock som RhD- med tanke på transfusionsterapi. Med detta tillvägagångssätt klassificerades gravida kvinnor med partiellt D-antigen som D-variant eller Du. och de fick ingen immunprofylax; följaktligen förhindrades inte de immuniseringshändelser som berodde på graviditet. På vårt center har fall med oklara resultat av serologisk RhD-typning sedan 2008 genomgått molekylär RHD-analys, och immunprofylax har genomförts för kvinnor som genotypats som partiella D-bärare. Andra studier pekar också på vikten av genotypning av RHD hos gravida kvinnor med D-variantantigen för att korrekt identifiera partiella D-bärare som behöver immunprofylax .

Alla tre alloimmuniserade partiella D-kvinnor i vår undersökning fick ingen immunprofylax, och två av dem fick RhD+-enheter av RBC, eftersom de ursprungligen inte erkändes som bärare av D-varianter och typades som RhD+. Endast 1 immuniseringshändelse hos en partiell D-kvinna var helt kopplad till graviditeten. För de återstående 2 RhD-immuniseringarna var det inte möjligt att fastställa om transfusion eller graviditet orsakade immuniseringen. Detta tyder på att det är viktigt att känna igen D-varianter vid serologisk typning för att säkerställa att gravida partiella D-bärare behandlas som RhD- med tanke på transfusionsbehandling och immunprofylax.

Efter att RhD-typning i IAT förkastades för gravida kvinnor 2008, typades de med DVI-variant, om de fanns i vår obstetriska population, som RhD- medan de tidigare tilldelades D-variant eller Du, eftersom DVI ger positiva reaktioner vid indirekt agglutination med anti-D-reagens som används för IAT-typning. Vi fann dock inga fall av anti-D hos DVI-mödrar. Trots att DVI-varianten hålls för den mest kliniskt relevanta partiella D-varianten bland kaukasier , tillhörde de drabbade kvinnorna i vår studie kategorierna DVa och DNB. I den forskning som utfördes på blodgivare från samma geografiska område hittades dessutom inga bärare av den partiella DVI-kategorin . DNB är känd för att vara den vanligaste partiella D-varianten i de angränsande regionerna i Centraleuropa . I vårt fall kom den enda DNB-bäraren från en angränsande geografisk region i Bosnien och Hercegovina, medan båda DVa-bärarna kom från det undersökta området Split-Dalmatia County. Detta innebär att man måste ta hänsyn till den geografiska variationen i prevalensen av D-varianter när man genomför RhD-typning och normer för immunprofylax.

Ingen fall av anti-D-bildning hos kvinnor som ursprungligen tilldelats RhD+ eller Du-status tillskrevs svaga D-typer när genotypning utfördes på de registrerade alloimmuniserade fallen. Detta var väntat eftersom de vanligaste svaga D-varianterna i Kroatien är svaga D typ 3, typ 1 och typ 2, medan den vanligaste varianten i Medelhavsdelen av Kroatien, där studien utfördes, är svaga D typ 1, följt av typ 3 och 2 . I motsats till vad författare i icke-kaukasiska populationer har konstaterat, där svaga D-typer som är benägna att bilda anti-D är vanliga, är det säkert att anta att svaga D-bärare i vår förlossningspopulation inte behöver immunprofylax . Eftersom man i en tidigare publicerad studie om den kroatiska befolkningen fann att den svaga D-typen 4.2, som är känd för att bilda anti-D, förekom i Medelhavsdelen av Kroatien, är försiktighet dock obligatorisk. I en studie om RhD-gravida kvinnor av Hyland et al. hittades dessutom D-variantbärare bland alloimmuniserade kvinnor. Vissa partiella D-RBC reagerar inte med anti-D även med IAT . I vår studie utfördes ingen genotypning av alloimmuniserade RhD-kvinnor; därför kan vissa D-variantbärare med anti-D ha missats av våra serologiska tekniker som användes vid den tidpunkten.

I likhet med resultaten från de flesta andra författare resulterade anti-D-immuniseringar av kvinnor med partiell D oftast i serologiska markörer för HDFN, men utan allvarliga kliniska konsekvenser . Det är intressant att notera att i vår studie födde kvinnan med den högsta anti-D-titern av alla tre kvinnor barn vars DAT endast var 1+, medan barnen till kvinnan med lägre titer var mer framträdande serologiskt påverkade, med DAT 4+. De faktorer som påverkar svårighetsgraden av HDFN är fortfarande föremål för potentiell forskning . Trots att de flesta fall av HDFN hos mödrar med partiell D-behandling är lindriga har det också rapporterats om dödlig utgång .

Men även om anti-D-bildning hos kvinnor som inte är RhD-kvinnor är extremt sällsynt, bekräftar de påvisade immuniseringshändelserna att det är relevant att korrekt identifiera partiella D-bärare, som måste betraktas som RhD-kvinnor med tanke på transfusionsterapi och immunprofylax. Nyligen genomförd forskning från USA visade att genotypning av RHD hos gravida kvinnor med serologiskt svaga D-fenotyper är en kostnadsneutral strategi, med kostnadsbesparingar som sannolikt kommer att öka något med tiden . Förutom den obestridda betydelsen av RHD-genotypning för att lösa diskrepanta RhD-typningsresultat och upptäcka D-varianter är det nödvändigt att betona betydelsen av serologisk typning, eftersom behovet av genotypning inte kommer att uppmärksammas om D-varianter inte uppmärksammas under den första serologiska typningen och bärare av D-varianter tilldelas RhD+. I vår studie blev alla tre gravida kvinnor med anti-D inte initialt erkända som D-varianter på grund av den starka reaktiviteten hos deras röda blodkroppar med monoklonala reagens som användes vid den tidpunkten. Vi kan dra slutsatsen att valet av reagenser för serologisk RhD-typning är avgörande för att man ska kunna känna igen D-varianter, och följaktligen för att man ska inse behovet av molekylär RhD-typning.

Finalt fann vi i denna studie att det inte hade förekommit RhD-immuniseringsfall hos gravida kvinnor som ursprungligen typades som D-variant, men vaccinationerna förekom hos kvinnor som typades som RhD+. Detta innebär ett behov av ytterligare undersökningar för att göra ett lämpligt val av reagens för serologisk RhD-typning som kommer att upptäcka D-varianter med risk för anti-D alloimmunisering i vår population.

Begränsningarna i denna retrospektiva studie är lång uppföljningsperiod, förändringar i metoder och reagenser som användes under studieperioden samt testalgoritmen. Förändringarna omfattar utelämnande av RhD-typning i IAT efter 2008 och införande av immunprofylax för gravida kvinnor med partiellt D-antigen efter 2008, medan profylax före 2008 inte gavs till kvinnor med någon D-variant. En annan begränsning i vår studie är att genotypning inte utfördes hos alloimmuniserade RhD-kvinnor.

Trots dessa begränsningar anser vi att det är mycket viktigt att följa upp den obstetriska populationen under lång tid. Detta skulle göra det möjligt för oss att bedöma lämpligheten av RhD-antigenets serologiska typningsstrategi och immunprofylaxadministration hos gravida kvinnor med D-varianter.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma mot Pera Erceg-Maglic, Hanija Dadic-Jadric, Branka Skelin, Dejana Bogdanic, Ivica Bradaric, Vedrana Burilovic och Nina Ipavec för att de har samlat in data under forskningen.

Etiska förutsättningar

Studien godkändes av den etiska kommittén vid Split University Hospital Center.

Oppenbarhetsförklaring

Författarna uppger inga intressekonflikter.

Författarkontakter

Artikel/Publikationsuppgifter

Upphovsrätt / Läkemedelsdosering / Ansvarsfriskrivning

Upphovsrätt: Alla rättigheter förbehållna. Ingen del av denna publikation får översättas till andra språk, reproduceras eller användas i någon form eller på något sätt, elektroniskt eller mekaniskt, inklusive fotokopiering, inspelning, mikrokopiering eller genom något informationslagrings- och informationssökningssystem, utan skriftligt tillstånd från utgivaren.
Läkemedelsdosering: Författarna och förlaget har gjort sitt yttersta för att se till att läkemedelsval och dosering som anges i denna text överensstämmer med aktuella rekommendationer och praxis vid tidpunkten för publiceringen. Med tanke på pågående forskning, förändringar i statliga bestämmelser och det ständiga flödet av information om läkemedelsbehandling och läkemedelsreaktioner uppmanas läsaren dock att kontrollera bipacksedeln för varje läkemedel för eventuella förändringar i indikationer och dosering och för tillagda varningar och försiktighetsåtgärder. Detta är särskilt viktigt när det rekommenderade medlet är ett nytt och/eller sällan använt läkemedel.
Disclaimer: Uttalandena, åsikterna och uppgifterna i denna publikation är enbart de enskilda författarnas och bidragsgivarnas och inte utgivarnas och redaktörernas. Förekomsten av annonser eller/och produktreferenser i publikationen är inte en garanti, ett stöd eller ett godkännande av de produkter eller tjänster som annonseras eller av deras effektivitet, kvalitet eller säkerhet. Utgivaren och redaktören/redaktörerna frånsäger sig allt ansvar för eventuella skador på personer eller egendom till följd av idéer, metoder, instruktioner eller produkter som det hänvisas till i innehållet eller annonser.