Alai

RTT-fibroblaster uppvisar en bristfällig aktivering av autofagi vid svält

För att verifiera hypotesen om bristande autofagi hos RTT-patienter, analyserade vi autofagyaktivering under svältförhållanden i primära hudfibroblaster som isolerats från RTT-patienter (n = 4) och friska personer (n = 4)17,19.

Vi definierade först livsdugligheten över tid hos friska och RTT-fibroblaster odlade i svältmedium genom både MTT- och Trypanblåsexklusionstest. När det gäller livskraften hos RTT-fibroblaster som odlats i standardmedium minskade RTT-fibroblasternas livskraft efter 4 timmars svält (20 ± 3,3 % av döende celler, p < 0,05); denna procentsats ökade avsevärt efter 6-8 timmars svält (60 ± 5,1 % av döende celler, p < 0,05) (Fig. 1a). Omvänt var friska fibroblaster fortfarande fullt livskraftiga efter 4 timmars svält med endast en mycket liten minskning av livskraften efter 6-8 timmar (10 ± 1,2 % av döende celler, p < 0,01) med avseende på livskraften hos fibroblaster som odlats i standardmedium (fig. 1a). Så som från en direkt jämförelse av livskraften hos de två cellinjerna vid varje tidpunkt kom det alltså fram att livskraften hos RTT-fibroblasterna var allvarligt nedsatt från och med tid 4 h (se detaljer i figurens legender, p < 0,05). Dessutom visade en Western Blotting (WB)-analys att i RTT-fibroblaster som hade utsatts för svält i 4 timmar var ett band som motsvarade p25-fragmentet av poly(ADP-ribose)polymeras-1 (PARP) kraftigt förhöjt (96 ± 4 %, p < 0,001) jämfört med den svaga upptäckten vid tidpunkt 0. Detta fragment frigörs av den caspasberoende nedbrytningen av proteinet under den tidiga fasen av induktion av apoptos (fig. 1b)35. P25-fragmentet var nästan odetekterbart i de friska fibroblasterna under samma experimentella förhållanden.

Dessa data bekräftade att RTT-fibroblasterna inte tolererade tillväxt i ett svältmedium och snabbt genomgick apoptos. Därför undersökte vi ytterligare det autofagiska flödet genom att övervaka LC3B-II-markörens clearance i närvaro och i frånvaro av en lysosomhämmare, såsom klorokin (CQ)24,25,26,27,28,29,30.

Efter att ha uteslutit en CQ-relaterad cytotoxisk effekt (kompletterande figur S1) odlades friska och RTT-fibroblaster antingen i vilo- eller svältmedier i 2 timmar i närvaro eller frånvaro av 20 µM CQ för att kvantifiera förhållandet LC3B-II/GAPDH med WB (fig. 2a). Mönstret för LC3B-II/GAPDH-förhållandet (eller någon annan intern kontroll som inte moduleras av autofagi) under förhållanden med autofagiaktivering och i närvaro och frånvaro av CQ (eller någon annan lysosomal hämmare) anses vara en giltig strategi för att övervaka autofagiflödet.

I friska fibroblaster, odlade i standardmedium, var LC3B-I tydligt immunodetekterad, medan LC3B-II var svagt. Förhållandet LC3BII/GAPDH i friska fibroblaster som odlats i standardmedium i frånvaro och i närvaro av CQ var jämförbart (fig. 2a, vänster panel). Denna observation tyder på att den basala autofagin var nästan omöjlig att upptäcka i de friska fibroblasterna (fig. 2a, vänster panel).

När dessa celler odlades i svältmedium och i frånvaro av CQ i 2 timmar ökade LC3B-II/GAPDH-kvoten (60 ± 4.8 %, p < 0,05) jämfört med friska fibroblaster som odlades i standardmedium antingen i frånvaro eller närvaro av CQ (vilket som tidigare nämnts var identiskt) (fig. 2a, vänster och höger panel). Detta beteende tyder faktiskt på att LC3-I faktiskt genomgick lipidering för att bilda LC3B-II, som är en tidig markör för autofagiaktivering24,25,26,27,28,29,30. För att testa förekomsten av denna autofagiaktivering odlade vi celler i ett svältmedium i närvaro av CQ i 2 timmar och de uppvisade en ytterligare ökning av LC3B-II/GAPDH-förhållandet (94 ± 5,5 %, p < 0,001) i förhållande till friska fibroblaster som odlades i standardmedium (fig. 2a, vänster och höger panel).

För övrigt var skillnaden mellan LC3B-II/GAPDH-förhållandet hos friska fibroblaster som odlades i svältmedium i frånvaro och i närvaro av CQ statistiskt signifikant (p < 0,05, fig. 2a, vänster panel)

Så enligt standardtolkningen av LC3B-II-mönstret genom WB-analys tyder det övergripande resultatet på att friska fibroblaster i avsaknad av näringsämnen stimulerar bildandet av autofagosomer som genomgår ackumulering i närvaro av CQ. Detta beteende är förenligt med ett normalt autofagiskt flöde24,25,26,27,28,29,30. När det gäller RTT-fibroblaster som odlas i standardmedium är det intressant att LC3B-I klart immunodetekterades, medan LC3B-II var mycket svag i cellerna både i frånvaro och i närvaro av CQ (fig. 2a, vänster panel). Under svältförhållanden och i avsaknad av CQ, framträdde ett svagt band som motsvarar LC3B-II i RTT-fibroblaster först efter lång exponering av filtret, vilket tyder på att åtminstone en minimal lipidering av LC3B-I inträffade (fig. 2a, vänster panel). Följaktligen ökade LC3B-II/GAPDH-förhållandet mellan RTT-fibroblaster som odlades i svältmedium i avsaknad av CQ (93 ± 5,5 %, p < 0,001) i förhållande till RTT-fibroblaster som odlades i standardmedium i avsaknad av CQ (fig. 2a, höger panel).

Däremot ökade inte administreringen av CQ till RTT-fibroblaster som odlades i svältmedium ytterligare LC3B-II/GAPDH-förhållandet som ökade (95 ± 3,5 %, p < 0,001) om man jämförde med celler som odlades i standardmedium i avsaknad av CQ, men som inte var signifikant förhöjt med avseende på LC3B-II/GAPDH-förhållandet hos RTT-fibroblaster som odlades i svältmedium i avsaknad av CQ (fig. 2a, vänster panel). Detta resultat tyder på att det inte sker någon ackumulering av autofagosomer i RTT-celler och WB-analysen stödde ett block, på någon nivå, i autofagiflödet24,25,26,27,28,29,30,31.

För att ytterligare stärka vår hypotes om ett eventuellt defekt autofagiflöde verifierade vi nedbrytningen av två erkända autofagireportersubstrat i friska och RTT-fibroblaster som svalts i 2 och 4 timmar i avsaknad av CQ, nämligen: (i) proteinet p62/SQSMT1, som hjälper till att rensa bort polyubiquitinerade proteinaggregat och som i sig självt bryts ned av lysosomala hydrolaser36, (ii) 20 S-proteasomen, som snabbt bryts ned under svältförhållanden37,38. Med avseende på basnivån av de två proteinerna (dvs. tidpunkt 0) observerades en minskning över tiden av förhållandet p62/tubulin (44 ± 10 % efter 4 timmar, p < 0,001) och av förhållandet PSMA-3/GAPDH (dvs. α7-underenheten av 20 S-proteasomen) (45 ± 3,1 % efter 2 timmar, 11 ± 5,2 % efter 4 timmar, i båda fallen p < 0,001) i friska fibroblaster (fig. 2b, övre panelen).

I fallet med RTT-fibroblaster var minskningen av förhållandet p62/tubulin över tiden inte statistiskt signifikant ens efter 4 h (89 ± 9 %), medan minskningen av förhållandet PSMA3/GAPDH vid 2 h (81 ± 4,4 %, p < 0,05) och 4 h (78 ± 5,1 %, p < 0,05) skiljde sig signifikant åt om man jämförde med proteins basala nivå (dvs. tid 0) (fig. 2b, nedre panel). Skillnaderna mellan de friska grupperna och RTT-grupperna var dock statistiskt signifikanta när det gäller förhållandet p62/tubulin endast vid 4 h (p < 0,05), medan förhållandet PSMA3/GAPDH skiljde sig signifikant mellan försöksgrupperna både vid 2 h (p < 0.05) och 4 h (p < 0,001) (fig. 2b, nedre panelen) (fig. 2b, nedre panelen).

Interessant nog var β-tubulin- och GAPDH-mönstren, som användes som interna kontroller för p62- respektive PSMA3-färgningen, oförändrade under 4 h svält i friska fibroblaster. Intensiteten hos β-tubulinbandet, liksom hos GAPDH-bandet, minskade dock avsevärt i RTT-fibroblaster som utsatts för svält under 4 timmar jämfört med vad som observerades vid tidpunkt 0 eller tidpunkt 2 timmar för dessa celler (fig. 2b, övre panelen). Denna minskning berodde troligen på det lägre antalet levande RTT-fibroblaster som skördades vid denna tidpunkt (i överensstämmelse med RTT-fibroblasternas dåliga livskraft vid 4 timmars svält som rapporterades i fig. 1a) och inte på en nedreglering av β-tubulin över tiden. Som helhet visade det sig att RTT-fibroblasterna inte effektivt bröt ned dessa autofagireporter-substrat, vilket stödjer hypotesen om en defekt autofagi.

För att kasta ytterligare ljus över egenskaperna hos denna blockering utförde vi en immunofluorescensanalys med hjälp av LC3B-antikroppen. Vi analyserade friska och RTT-fibroblaster som odlades i standardmedium i avsaknad av CQ (vilotillstånd) och i svältmedium i 2 timmar i närvaro eller avsaknad av 20 µM CQ (fig. 2c). I överensstämmelse med primärcellernas långsamma ämnesomsättning fann vi att friska fibroblaster och RTT-fibroblaster i vila uppvisade en svag och diffus LC3B+-färgning med en låg procentuell andel celler som uppvisade fler än 10 prickar (dvs. autofagosomer) (8 ± 5 % respektive 1 ± 0,5 %), vilket tyder på att den basala autofagin med hjälp av immunofluorescens var dåligt påvisbar i enlighet med de data som rapporteras i Fig. 2a.

Med avseende på celler som odlats i standardmedium var andelen friska fibroblaster som odlats i svältmedium (i avsaknad av CQ) och som uppvisade minst 10 LC3B+ autofagosomer markant förhöjd (82 ± 10 %, p < 0,005), medan RTT-fibroblaster som odlats i svältmedium uppvisade en svag ökning (17 ± 8 %, p < 0,001). Faktum är att andelen friska fibroblaster som odlades i svältmedium och som uppvisade minst 10 autofagosomer var betydligt högre än andelen RTT-fibroblaster som odlades under samma försöksbetingelser (p < 0,005). Autofagosomerna var huvudsakligen lokaliserade till den perinukleära regionen. I närvaro av CQ observerades vidare en förväntad diffus och intensiv LC3B+ färgning, även om den diffusa färgningen i detta fall inte gjorde det möjligt att exakt kvantifiera antalet prickar.

Administrering av CQ var ineffektivt i RTT-fibroblaster, vilket tydligt indikerar en allvarligt nedsatt autofagosombiogenes (fig. 2c).

Med tanke på relevansen av den förmodade försämringen av autofagosombiogenesen antogs en ytterligare metod för att bekräfta denna observation. Både friska och RTT-fibroblaster, som svalts i 2 timmar i avsaknad av CQ, färgades med ett specifikt färgämne (Cyto-ID) för det autofagosomala membranet och analyserades med immunofluorescens. Även i detta fall, medan man i friska fibroblaster faktiskt upptäckte flera autofagosomer, observerades i RTT-fibroblaster endast ett begränsat antal små och isolerade vesiklar (kompletterande figur S2). Skillnaden i andelen celler som uppvisar minst 5 Cyto-ID-positiva prickar mellan friska fibroblaster och RTT-fibroblaster var markant signifikant (80 ± 4 % respektive 8 ± 6 %, p < 0,001). Därför gav den övergripande analysen bevis för att en defekt autofagosombiogenes förekommer i primära RTT-fibroblaster.

Mogna röda blodkroppar från RTT-patienter som bär på R255X MeCP2-mutationen behåller mitokondrier

Nästan försökte vi avgöra om ytterligare tecken på defekt autofagi kunde observeras ex vivo hos RTT-patienter. På grund av det faktum att mitokondrieclearance är en klassisk autofagibaserad mekanism som förekommer i cirkulerande retikulocyter i slutskedet av mognaden till RBC32,33,34 utvidgade vi vår undersökning även till ex vivo humana RBC för att verifiera om mitokondrier bibehålls i dessa celler.

Därmed analyserades RBC från RTT-patienter (n = 15) och från friska donatorer (n = 11) med transmissionselektronmikroskopi (TEM). TEM-undersökningen belyste förekomsten av strukturer som liknar mitokondrier (SRM) i bikonkava formade RBC som isolerats från majoriteten av RTT-patienterna (11 av 15). Bland dessa 11 RTT-patienter uppvisade tre av dem den allvarligaste kohorten av symtom och även en hög frekvens av RBC (20 ± 4 %) (fig. 3a-h). Som förväntat var SRM odetekterbara i friska RBC (fig. 3I). Skillnaderna mellan friska och RTT-personer var statistiskt signifikanta (p < 0,0004; Fig. 3, nedre panelen).

När det gäller symtomens svårighetsgrad baserades dock på den kliniska bedömningen och följaktligen bar de tre patienterna med de svåraste symtomen alla på R255X-mutationen i MeCP2-genen, som är förknippad med en allvarlig prognos39.

Som en följd av detta och med tanke på att vi inte hade någon möjlighet att rekrytera ett större antal försökspersoner med andra mutationer som har en låg eller nollfrekvens av mitokondriehållande röda blodkroppar, fokuserade vi vår uppmärksamhet på analysen av dessa tre patienter. TEM-analysen dokumenterade i dessa tre ovan nämnda fall förekomsten av strukturer som liknade intakta eller delvis smälta mitokondrier (antingen elektrontäta eller genomskinliga), som var normal- eller hantelformade (långsträckta) och i allmänhet små med svaga cristae (fig. 3a-h). Storleken och den övergripande formen på dessa strukturer visade sig faktiskt stämma överens med de mitokondrier som behålls i mogna RBC i icke-RTT murinmodeller av defekt makroautofagi (dvs. Ulk1-/-möss) eller mitofagi (dvs. Nix-/-möss) som rapporterats av andra författare32,33. Intressant nog har de morfologiska förändringar av mitokondrierna som vi observerade, t.ex. den minskade dimensionen, den långsträckta (dvs. hantelformade) strukturen och i synnerhet närvaron av svaga cristae redan beskrivits i muskler och i lillhjärnan hos RTT-patienter20,21. För att bekräfta den mitokondriella identiteten hos SRM färgade vi RBC från friska donatorer och dessa RTT-patienter med allvarliga symtom med en anti-COX-IV-antikropp (cytokrom c-oxidas). Ett statistiskt signifikant antal RBC från de tre RTT-patienterna i jämförelse med RBC från friska försökspersoner (35 ± 5 % respektive 0,2 ± 0,01 %, p < 0,005) uppvisade ett COX-IV+ prickigt mönster som tydde på att mitokondrierna fanns kvar (fig. 4). Det genomsnittliga innehållet av mitokondrier per cell beräknades till 1,2 ± 0,2 organeller per RBC hos RTT-patienter och 0,002 ± 0,0002 hos friska försökspersoner (p < 0,005) (fig. 4). Skillnader i procentuell andel RBC som uppvisar mitokondrier mellan TEM- och IF-undersökningarna kan bero på att möjligheten att upptäcka organellerna med TEM är strikt beroende av det tunna snittet av cellen, vilket kan hindra deras närvaro, medan IF-metoden inte är begränsad på detta sätt.

För att ytterligare bekräfta dessa resultat utförde vi en cytofluorimetrisk analys av RBC från både friska försökspersoner och de tre RTT-patienterna med hjälp av en anti-CD71- (transferrinreceptor) och anti-COX-IV-antikroppar. Frekvensen av CD71-positivitet, en markör för omogna RBC, var inte signifikant annorlunda hos friska och RTT-patienter (1,34 ± 0,13 % jämfört med 1,03 ± 0,3 %; kompletterande figur S3). Det bör understrykas att de RTT-patienter som ingick i studien uppvisade normala hematologiska parametrar och även om retikulocytindexet, åtminstone hos ett par personer, var lägre än hos friska personer, var de övergripande skillnaderna mellan de två patientgrupperna inte statistiskt signifikanta (tabell 1). Omvänt observerades en mycket svag COX-IV+-population i friska RBC, medan en högre frekvens av COX-IV+-celler upptäcktes i RTT-RBC (0,056 ± 0,004 % respektive 1,15 ± 0,19 %, p < 0,01). Dessa resultat bekräftades ytterligare med hjälp av färgning med Mitotracker Green (MT) (kompletterande figur S3), som dokumenterade en ökning av MT+ RBCs hos en RTT-patient (som bär på R255X MeCP2-mutationen) jämfört med en frisk patient (0,37 % vs 0,16 %), i likhet med vad som observerades med COX-IV-antikroppen som tidigare beskrivits.

För att ytterligare validera SRM:s identitet lyserades ett lika stort antal RBC och analyserades med WB under denaturerande och reducerande förhållanden. Filtren färgades med antikroppar mot sirtuin-3, ett de-acetylas som uttrycks specifikt i mitokondriernas matris40. Sirtuin3 valdes som en mitokondriell markör i detta tillvägagångssätt eftersom dess molekylvikt, till skillnad från COX-IV och andra mitokondriella markörer, inte överlappar molekylvikten för hemoglobinkedjor eller hemoglobinoligomerer i det elektroforetiska mönstret. Hos de tre undersökta RTT-patienterna observerades en statistiskt signifikant ökning av sirtuin-3/GAPDH-förhållandet för varje patient med avseende på samma förhållande i lysat från friska RBC (p < 0. 001) (Supplementary Fig. S4).

Dessa tre patienter, som alla bär på MeCP2-mutationen (dvs. R255X), uppvisade den sämsta fenotypen, med en mycket hög andel av RBC som uppvisade minst 1 mitokondrie. Det mycket begränsade antalet patienter som vi hade till vårt förfogande gjorde det dock svårt att dra några statistiskt signifikanta slutsatser om möjligheten av ett samband mellan sjukdomens svårighetsgrad och omfattningen av mitokondriernas retention inuti mogna RBC. En annan punkt som verkar vara värd att nämna är att retention av mitokondrier inuti mogna RBC i de tidigare nämnda Ulk1-/- och Nix-/- murinmodellerna ledde till anemi eller andra blodpatologier som troligen bestämdes av den ökade rensningen av dessa onormala erytrocyter av mjältmakrofager32,33. Hos de RTT-patienter som ingick i den här studien registrerades endast en mycket begränsad och inte statistiskt signifikant minskning av de hematologiska värdena, och de verkade inte vara anemiska eller lida av andra blodpatologier. Diskrepansen mellan våra resultat och resultaten från murinmodellerna kan bero på att nedsättning av makroautofagi eller mitofagi generna (dvs. Ulk1-/- respektive Nix-/- möss) leder till en mycket hög procentandel mitokondriehållande röda blodkroppar och till att flera organeller hålls kvar i röda blodkroppar, vilket är en betydligt allvarligare defekt än den som dokumenterats hos RTT-patienter32,33 . Även om vi observerade ett betydligt högre antal mitokondriehållande RBC hos patienter som bär på R255X-mutationen (fig. 4) var antalet organeller i varje cell mycket lågt i RTT-RBC (fig. 4). Detta är kanske inte tillräckligt för att driva stora morfologiska och funktionella förändringar i RBC. Det är värt att nämna att även om mitokondriernas kvarhållande i RBC kan vara åtminstone en faktor som bestämmer den allvarliga redoxobalans som observerats i RTT RBC i samband med en betydande förändring av energitillståndet och ämnesomsättningen (dvs, ATP/ADP och NADH/NAD-förhållandet), rapporterade nyligen genomförda studier att kinetiken för syrebindning till hemoglobin och syrediffusion nästan överlappar kinetiken hos friska patienter16,17,23,41 .

Den uppenbara diskrepansen mellan våra resultat och de som härrör från murinmodeller kan också finna en förklaring i det faktum att RTT-syndromet är en X-bunden sjukdom som nästan uteslutande drabbar det kvinnliga könet och att inaktivering av en av de två kopiorna av X-kromosomen (XCI) är ett slumpmässigt fenomen som uppträder under embryogenesen, vilket är allmänt dokumenterat42,43. När det gäller RTT-syndromet förväntas den slumpmässiga XCI-variationen i somatiska celler ge upphov till en mosaikism där hälften av cellerna uttrycker vildtypsallelen och den återstående hälften uttrycker den muterade allelen av MeCP2-genen. Intressant nog stämmer möjligheten att åtminstone vissa MeCP2-mutationer kan förknippas med en icke slumpmässig XCI i neuronal vävnad överens med den fenotypiska variabiliteten hos RTT-patienter (och även för de välkända fallen av RTT), en egenskap som har dokumenterats utförligt42,43 . Teoretiskt sett, om hälften av de hematologiska progenitorerna i benmärgen behåller den X-kromosom som bär på MeCP2-mutationen, skulle endast hälften av de cirkulerande mogna röda blodkropparna bära den patologiska allelen, vilket begränsar antalet cirkulerande röda blodkroppar som innehåller mitokondrier. Icke desto mindre har en ökad prevalens av icke slumpmässig XCI till förmån för vildtypsallelen observerats i cirkulerande leukocyter hos sporadiska RTT-patienter42,43. När det gäller denna punkt skulle det vara en stor utmaning att ta reda på om de patienter som uppvisar eller inte uppvisar ett lågt antal mitokondriehållande RBC också uppvisar en mindre betydande försämring av mitofagi eller icke slumpmässig XCI, vilket skulle leda till ett positivt urval av hematologiska progenitorer som bär på MeCP2-allelen av vildtyp.

Med tanke på RTT-patologins komplexitet föredrar vi att hävda att RTT-patienterna, tillsammans med de patienter som drabbats av Pearson-syndromet, skulle kunna utgöra de första fallen av mitokondrieretention i mänskliga mogna RBC44.

Bevis på defekt autofagi i cerebellum hos Mecp2-nullmöss

Med tanke på att RTT är en neuroutvecklingssjukdom, och för att ytterligare stödja våra resultat som pekar på en systemisk defekt autofagi, utförde vi immunhistokemiska analyser för p62 och ubiquitin i cerebellum (i.dvs. ett organ där mitokondriaförändringar och andra större histologiska avvikelser har observerats)21,45 hos 9 veckor gamla vildtypmöss och 5 veckor gamla (asymtomatiska) och 9 veckor gamla (symtomatiska) Mecp2 -/y-möss. För varje experimentellt tillstånd analyserades det organ som isolerats från tre djur. Jämfört med wt visade RTT-cerebellum en ökning av intensiteten av p62- (fig. 5a) och Ub- (fig. 5b) färgning i alla skikt (dvs. granuler, Purkinje- och kortikalskikt), vilket var linjärt med djurens ålder. Dessutom liknade de hyperfärgade strukturerna intracellulära aggregat. Enligt den semikvantitativa utvärderingen av intensiteten av färgningen av antingen p62/SQSTM1 och Ub var skillnaderna mellan lillhjärnan hos 5-veckors djur jämfört med friska djur och hos 9-veckors djur jämfört med 5-veckors djur statistiskt signifikanta (p < 0.05).

Den histologiska skillnaden mellan asymptomatiska och symtomatiska djur tyder på att autofagiförändringen skulle kunna vara frånvarande eller svag vid födseln, medan den successivt ökar under de första levnadsveckorna (och möjligen när MeCP2-aktiviteten når en topp), vilket ger upphov till symptomen.