Alai

En kortfattad historia av T. reesei

De äldsta biotekniska metoderna som involverar svampar för att framställa öl, vin och ost kan dateras till flera årtusenden tillbaka, dvs. till början av den litterata civilisationen själv. Upptäckten av den filamentösa mesofila ascomyceten Trichoderma reesei (då Trichoderma viride) för dess häpnadsväckande potential att producera extracellulära cellulaser ägde däremot rum för bara drygt 70 år sedan. Till en början ansågs den destruktiva potentialen hos den ursprungliga Trichoderma sp. som isolerades från ruttnande utrustning från den amerikanska armén på Salomonöarna under andra världskriget vara ganska problematisk. Trots detta dröjde det inte länge innan forskare vid Natick Army Research Laboratories under ledning av Mary Mandels och Elwyn T. Reese, den namngivande forskaren, försökte omvandla denna problematiska potential till målinriktade produkter. I en screening av 14 000 mögel från Quartermaster Collection Trichoderma sp. QM6a en enastående förmåga att bryta ned naturlig kristallin cellulosa. Beteckningen ”QM6a” för det sista kvarvarande ursprungliga Trichoderma-isolat, som identifierade det som den sjätte av sex kulturer av svampen som förvarades i Quartermaster Collection i Natick, kvarstod. Denna stam betraktas inte bara som T. reesei-referensstammen, utan är också den stam från vilken alla mutanter som används i industrin i dag har härletts.

Den gången och nu drivs forskningen om T. reesei av idén att dess utsöndrade cellulaser skulle kunna få en avgörande betydelse för den 200 år gamla kampen för att ekonomiskt producera bränslen från förnybar, lignocellulosabaserad biomassa . Forskningen om T. reesei har sedan dess varit banbrytande när det gäller konceptet med enzymatisk förkalkning av cellulosa genom en synergistisk kombination av olika cellulasaktiviteter och lagt grunden för vår nuvarande förståelse av regleringen av de inblandade enzymerna . Dess viktigaste cellobiohydrolas CBH1 (CEL7a) var också det första eukaryota cellulas som klonades och det första cellulas vars struktur löstes . Ett viktigt steg mot en industriell användning av T. reesei-cellulaser var utvecklingen av effektiva mutagenes- och screeningförfaranden för stammar under 1970-talet. Under de följande två decennierna kunde titern av extracellulärt protein som producerades av den ursprungliga stammen QM6a ökas med upp till 20 gånger genom mutagenesprogram vid Natick och Rutgers University. Det senare kulminerade i isoleringen av stam RUT-C30 (där ”RUT” står för Rutgers). Även om guldstandarden för cellulasproduktion inom industrin rapporterades vara högre än 100 g/L, är denna stam fortfarande prototypen av cellulashyperproducent som är tillgänglig för allmänheten med titrar av extracellulärt protein som når 30 g/L på det cellulasinducerande substratet laktos .

I början utvecklades dock andra kommersiella användningsområden för cellulaser, eftersom det stod klart att en effektiv och fullständig förkalkning av lignocellulosabiomassa till jäsbara sockerarter kräver många fler enzymatiska aktiviteter än vad som först förväntades. Återigen fortsatte forskningen med T. reesei att bryta ny mark inom enzymologin för nedbrytning av både cellulosa och hemicellulosa och gör det fortfarande i dag . Genom atomkraftmikroskopi med hög hastighet har man nu också visualiserat cellulosnedbrytningen och visat hur det viktigaste cellobiohydrolaset CBH1/CEL7A glider enkelriktat längs celluloselytan . I början av 1990-talet hade transformationsmetoder som underlättar genteknik av T. reesei blivit tillgängliga . Under det kommande decenniet var denna teknik avgörande för att få nya insikter i regleringen av dess enzymer och för att förändra den enzymprofil som svampen utsöndrar . Vid den tiden var T. reesei också en av de första värdarna för att uttrycka däggdjursproteiner, vilket exemplifieras av uttrycket av kalvchymosin under cbh1 (cel7a)-expressionssignaler .

I slutet av 1990-talet upptäckte Kuhls et al. att Hypocrea jecorina i själva verket är den sexuella formen av T. reesei, vilket är anledningen till att ett antal efterföljande publikationer använde H. jecorina som artnamn i stället för T. reesei. En mer detaljerad studie av den sexuella utvecklingen ledde till hypotesen att stam QM6a i själva verket är honsteril, vilket senare kunde kopplas till en mutation i den MAP-kinas-kapselkodande genen ham5 .

Till millennieskiftet, som för genetiken kan ses som en vändning från studiet av isolerade gener och vägar till studiet av hela genomer, kom T. reesei in i den s.k. genomiska eran. Det första globala tillvägagångssättet för att studera T. reeseis genuttryck 2003 var en transkriptomisk studie av Foreman et al. som konstruerade DNA-mikroarrays baserade på cDNA:er som motsvarade över 5 000 olika transkript i T. reeseis genom. Fem år senare lade sekvenseringen av genomet och analysen av det ursprungliga T. reesei-isolat QM6a grunden för en bred tillämpning av undersökningar av hela genomet. Under de följande åren ledde en jämförande genomisk analys av ett antal stammar som producerar cellulas i hög grad och stammar som inte producerar cellulas till att man upptäckte nya potentiella faktorer som är involverade i cellulas i hög grad, t.ex. nukleocytoplasmatisk transport, vakuolär proteintrafik och mRNA-omsättning . Dessa jämförande analyser gynnades av det faktum att alla T. reesei-stammar som används inom den akademiska världen och industrin härstammar från stam QM6a. Sextiofem år efter Elwyn Reese’s första studier om cellulosabedrift av T. reesei är den installerade produktionskapaciteten för cellulosabaserade biobränslen i världen nu 480,5 miljoner liter etanol per år, varav 380,5 miljoner liter etanol per år (eller ungefär 80 %) produceras med hjälp av enzympreparat av T. reesei, t.ex. Accellerase och Cellic (fig. 1a). Utan tvekan krävde detta arbete en mognad av den underliggande tekniken på flera nivåer, inklusive processteknik och substratförbehandling. Ändå var och är produktion och optimering av enzymformuleringar för biomassans förkalkningssteg en av de viktigaste faktorerna som bestämmer kostnadsprestandan för cellulosaetanolprocesser . Dessutom är enzymproduktion med hjälp av T. reesei inte alls begränsad till produktion av enzymer för bioraffinaderier. Ungefär 11 % av alla tekniska enzymformuleringar som registrerats av Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme Products produceras faktiskt med T. reesei som expressionsvärd (fig. 1b, c). Sist men inte minst behåller T. reesei fortfarande sin betydelse inom forskningen, vilket exemplifieras av mer än 100 forskningsartiklar som handlar om svampen eller dess enzymer och som publiceras varje år (fig. 1d).

The T. reesei biomass enzyme mix: new insights and limitations

In nature lignocellulose deconstruction is rarely accomplished by a single organism. Det sker snarare genom den sekventiella ordningen och den kollektiva ansträngningen av flera organismer som producerar flera kolhydrataktiva enzymer (CAZymes) för att bryta ned de olika polymererna. Det är därför inte förvånande att T. reeseis cellulasblandning måste anpassas avsevärt för att ge en konkurrenskraftig enzymformulering för fullständig förkalkning av lignocellulosa. Forskarna insåg tidigt att T. reesei-formuleringar saknade tillräcklig β-glukosidasaktivitet eftersom den största delen av aktiviteten är bunden till svampens cellvägg . Följaktligen förbättrade ökad β-glukosidasaktivitet nedbrytningen av cellulosa eftersom den motverkar produkthämning genom cellobiose, som i sin tur frigörs genom samverkan mellan endoglukanaser och cellobiohydrolaser . Denna återkopplingsmekanism bromsar annars allvarligt cellulosaförtjockningen. På samma sätt hämmar hemicellulosadrivna xylo- och mannooligosackarider cellobiohydrolaser hos T. reesei, vilket starkt tyder på att tillräcklig β-xylosidas- och β-mannosidasaktivitet krävs för att effektivt bryta ned lignocellulosa. År 2003 beskrev Foreman et al. två proteiner som saminduceras med de viktigaste cellulaserna och kallade dem cellulosainducerade protein 1 och 2 (CIP1 och CIP2). De har sedan dess visat sig vara viktiga för en effektiv nedbrytning av lignocellulosa. Nya resultat visar att CIP1 har strukturella likheter med lyaser, även om lyasaktivitet inte kunde påvisas, och att CIP2 är ett glukuronoylesteras av CE15-familjen . Ett annat viktigt utsöndrat protein är swollenin SWO1 som innehåller en kolhydratbindande modul (CBM) kopplad till en expansinliknande domän . Trots den cellulosaförstörande aktiviteten ökar SWO1 synergistiskt endoxylanas snarare än endoglukanas eller cellobiohydrolasaktiviteten under enzymatisk hydrolys av förbehandlad majsstubbe . Ett föreslaget verkningssätt är att den gör xylandelen av lignocellulosa mer tillgänglig för nedbrytning av xylanaser och därmed indirekt främjar cellulasernas verkan. Den största revolutionen på senare år när det gäller nedbrytning av cellulosa var utan tvekan upptäckten av de lytiska polysackaridmonooxygenaserna (LPMO). Dessa enzymer introducerade en ny oxidativ mekanism för polysackaridnedbrytning. Vid nedbrytning av cellulosa antar man att LPMO:erna verkar på ytan av kristallina cellulosafibriller och därigenom gör dem mer tillgängliga för cellulaser . Intressant nog kan dessa enzymer få de elektroner som behövs för denna process från lignin i växternas cellväggar via långväga elektronöverföring, vilket gör att växtens försvarsmekanismer vänder sig emot dem . Alternativt kan GMC oxidoreduktas eller cellobiose dehydrogenas fungera som elektrondonatorer . Detta fynd skulle mycket väl kunna förklara hur T. reesei ger bränsle till sina LPMO:er, eftersom det tidigare visats att flera sådana GMC-oxidoreduktaser faktiskt induceras av vetehalm . Denna oxidativa mekanism är dock inte alls begränsad till depolymerisering av cellulosa. LPMO:er som ursprungligen demonstrerades för kitin spelar också en roll vid nedbrytning av xyloglukan och amylos . I CAZy-databasen har enzymer som tillhör denna grupp omklassificerats till ”hjälpverksamhet” (AA) i motsats till deras tidigare klassificering som glykosidhydrolaser (t.ex. GH61) och återfinns i AA-familjerna 9-11 och 13 . Som tidigare nämnts är hemicellulolytiska aktiviteter viktiga för en fullständig förkalkning av lignocellulosa (se Harris et al. ). Olika mängder av enskilda aktiviteter krävs beroende på vilka hemicellulosatyper som finns i substratet . Det är därför anmärkningsvärt att den enzymatiska repertoaren hos T. reesei har vissa tydliga begränsningar för vissa typer av hemicellulosaspecifika bindningar. En sådan saknad aktivitet är α-xylosidas. Genom att tillsätta α-xylosidas till en kommersiell T. reesei-enzymformulering förbättrades frisättningen av xylos och glukos från förbehandlad majsstubbe . På samma sätt förbättrades en syntetisk T. reesei-enzymberedning avsevärt genom att tillsätta ett GH family 5-cellulas med aktivitet mot glukomannan och xylan . Andra aktiviteter som saknas eller är mycket begränsade i T. reesei-cellulasblandningen är endoarabinas och flera pektinasaktiviteter . Att komplettera kommersiella cellulaseblandningar med dessa enzymaktiviteter förbättrade följaktligen förkalkningen av olika substrat . En annan fråga som ännu inte har besvarats är funktionen in vivo av de sekretade laccasliknande multikopparoxidaser som kodas i T. reeseis genom.

Förbättring av T. reesei som värd för proteinproduktion

Med tanke på att cellulaserna och flertalet av de andra lignocellulosa nedbrytande enzymerna uttrycks på ett koordinerat och villkorligt sätt är transkriptionsregleringen av dessa ett logiskt mål för att förbättra svampens produktion av cellulas. En av huvudregulatorerna är transkriptionsfaktorn CRE1 av typen C2H2 som medierar repression av kolkataboliter. CRE1 stänger av transkriptionen av sina målgener när mer gynnsamma kolkällor som glukos är närvarande. Dess avkortning är en av huvudorsakerna till den förbättrade cellulasproduktion som uppnås genom slumpmässiga mutagenesprogram för T. reesei QM6a, vilket leder till stam RUT-C30, som uppvisar både en högre basal nivå och en högre inducerad nivå av cellulasproduktion . På samma sätt minskar repressionen av kolkataboliter och ökar transkriptionen av cel7a under aktiverande och reprimerande förhållanden om man ersätter CRE1-bindande motiv i promotorregionen för det stora cellobiohydrolaset cel7a med motiv från en känd cellulasaktivator. Dessutom är transkriptionen av cellulas, xylanas och ett antal andra gener som kodar för enzymer som är involverade i nedbrytningen av lignocellulosa strikt beroende av transkriptionsaktivatorn XYR1 av typen Zn(II)2Cys6 . Detta står i kontrast till andra svampar, däribland Sordariomyceterna Neurospora crassa och Fusarium fujikuroi, där XYR1-ortologen uteslutande modulerar xylanasets genuttryck. En mutation som leder till en trunkerad form av XYR1 visade sig orsaka den cellulasnegativa fenotypen hos stam QM9136 som härrör från mutagenesprogrammet vid Natick . Följaktligen har cellulas över- och hyperproducerande mutanter förhöjda nivåer av mRNA för transkriptionsaktivatorerna xyr1 . Det har också visat sig att överexpression av XYR1 leder till ett högre uttryck av cellulaser och upphäver deras katabolitrepression i närvaro av glukos . Dessutom leder en punktmutation inom en förmodad regulatorisk region av XYR1 till ett liknande avreglerat uttrycksmönster . Förutom XYR1 och CRE1 reglerar tre transkriptionsfaktorer ACE1, ACE2 och ACE3 uttrycket av cellulaser och xylanas i T. reesei . I likhet med CRE1 är ACE1 en C2H2-zinkfingerrepressor och dess deletion förbättrar därför produktionen av både cellulaser och xylanas. ACE2 och ACE3 är, precis som XYR1, transkriptionsaktivatorer av typen Zn(II)2Cys6 . När ace2 saknas minskar transkriptionen av cellulaser och xylanaser i motsvarande grad, även om cellulasinduktion av sophoros uppenbarligen förblir opåverkad . Deletion av ace3 upphäver helt och hållet transkriptionen av cellulaser, men reducerar endast xylanasernas transkription. Överexpression av ACE2 har ännu inte försökts, men överexpression av ACE3 leder till ökad aktivitet hos båda typerna av enzymer, liksom överexpression av sex andra hittills okaraktäriserade regulatorer . Dessa inkluderar ytterligare två transkriptionsfaktorer av Zn(II)2Cys6-typ samt två WD40-proteiner, ett bromodomänprotein och ett gcn5-relaterat acetyltransferas. Alla tre Zn(II)2Cys6-transkriptionsaktivatorer (XYR1, ACE2 och ACE3) liknar det väl karakteriserade Gal4-proteinet från S. cerevisiae. Det är väl etablerat att Gal4 rekryterar det Gcn5-innehållande SAGA-komplexet och därigenom främjar transkriptionen av sina målgener genom histonacetylering och euchromatinbildning. Gcn5-ortologen i T. reesei är oumbärlig för cellulasexpression och deltar i acetyleringen av histoner i cbh1-promotorn. På senare år har det vuxit fram en bild som visar att transkriptionen av cellulaser och besläktade CAZymer hos svampar styrs av en kombination av många transkriptionsfaktorer som utgör ett komplext transkriptionsreglerande nätverk som påverkas av motverkande aktivatorer och repressorer. I Penicillium oxalicum, till exempel, är det tjugo transkriptionsfaktorer som modulerar aktiveringen eller repressionen av cellulasegener. Bland dessa har ClrB identifierats som en viktig integratör för alla andra regulatorer och deras målgener. Homologer till dessa regulatorer finns i T. reesei, men med tanke på mångfalden av anpassningar i växternas cellväggsreglering förväntas andra och annorlunda regulatorer också spela viktiga roller. En annan viktig aktör i cellulaseregleringen är T. reeseis ortolog till den gåtfulla Aspergillus LaeA, som är inblandad i regleringen av genkluster av sekundära metaboliter i olika svampar . Medan borttagning av detta förmodade proteinmetyltransferas leder till en stark nedreglering av olika cellulas- och andra CAZyme-gener, kan dess överexpression kraftigt främja deras uttryck . Liknande effekter konstaterades för det LAE1-interagerande VEL1-proteinet i VELVET-komplexet .

De flesta av de ovan nämnda studierna ger grundläggande insikter i regleringen av cellulasebildningen. Eftersom de flesta av dessa studier utfördes antingen i det ursprungliga T. reesei-isolat QM6a eller den måttligt överproducerande stammen QM9414, är det fortfarande oklart om och i vilken utsträckning dessa effekter kan genomföras i hyperproducerande stammar. I dessa stammar kan processer som översättning, sekretion och omsättning av utsöndrade enzymer, snarare än transkription, begränsa en ytterligare ökning av cellulasproduktionen. Det blir intressant att se om flera av de rapporterade sätten att förbättra cellulasets genuttryck kan staplas eller inte och hur sådana stammar skulle prestera jämfört med de hyperproducenter som härrör från slumpmässig mutagenes.

Enbart att öka transkriptionen av den aktuella genen leder inte alltid till förbättrad produktbildning, särskilt när det gäller icke-svampiga proteiner. En framgångsrik strategi för att kringgå låg produktbildning är fusionsgenmetoden där man förutom promotor- och terminatorregionen i en högt uttryckt gen även använder det kodade proteinet som expressionsförstärkare. För T. reesei är detta cellobiohydrolaset som kodar för cel7A, vilket är det protein som uttrycks starkast under cellulasinducerande förhållanden. Man tror att dessa genfusioner i allmänhet ökar mRNA-stabiliteten, importen till ER och passagen genom den sekretoriska vägen. För detta ändamål utnyttjas ofta CEL7A:s modulära struktur som består av en katalytisk modul, en länkare och en CBM, varvid den C-terminala CBM:n ersätts med den aktuella genen. Det finns nu varianter av denna genfusionsmetod som riktar proteinet till ER för korrekt veckning, bildning av disulfidbryggor och glykosylering, men som därefter syftar till intracellulär proteinackumulering för att undvika att den önskade produkten bryts ned av extracellulära proteaser. I en sådan strategi används hydrofobiner med en fäst ER-hållningssignal som bärare. Dessa fusionsproteiner samlar sig själva till micellliknande strukturer och kan renas med hjälp av ett ytaktivt vattenbaserat tvåfasigt system . En annan strategi för att rikta proteiner till ER använder γ-zeinpeptiden (ZERA) som härrör från majsens lagringsprotein. På samma sätt bildar dessa självmonterande fusionsproteiner proteinkroppar som omges av ER-membran som skyddar dem från proteolys . För att utveckla svampar som effektiva produktionsvärdar för däggdjursproteiner krävs också att de proteaser som ofta förekommer i jäsningsbuljongen inaktiveras. I en systematisk studie identifierades olika sekretade proteaser som är relaterade till nedbrytning av biofarmaceutiska produkter, inklusive antikroppar, interferon α 2b och insulinliknande tillväxtfaktor, och flera av dem inaktiverades . Detta ledde inte bara till en drastisk minskning av proteasaktiviteten utan också till en kraftig ökning av stabiliteten hos alla tre rekombinanta proteiner, där antikroppen uppvisade den mest uttalade effekten. Även om man tidigare har försökt att konstruera N-glykosyleringsmönstret för produktion av terapeutiska proteiner av högt värde, verkar det för närvarande inte möjligt att skapa ett autentiskt mänskligt glykosyleringsmönster i ett svamputtrycksvärddjur. Det är därför tveksamt om sådana bioläkemedel kommer att produceras av svampcellsfabriker i framtiden, särskilt med tanke på den snabba utvecklingen av CHO-celler .

De ovan nämnda hydrofobinerna är en annan grupp av proteiner som fått stor uppmärksamhet på grund av deras ytaktiva egenskaper . Dessa små, extracellulära proteiner bildar självmant proteinskikt vid hydrofoba/hydrofila gränsytor på grund av sina amfifila egenskaper och gör hydrofoba ytor vätbara eller hydrofila ytor hydrofoba. De har en stor potential i livsmedels- och medicinska tillämpningar för att dispergera hydrofoba material, stabilisera skum eller rikta olika molekyler mot ytor . Cerato-plataniner är en annan grupp av små, utsöndrade proteiner med fyra bevarade cysteiner. De binder till chitin och N-acetylglukosaminoligosackarider och har egenskaper för självmontering vid hydrofoba/hydrofila gränsytor. I motsats till hydrofobiner förstärker cerato-plataniner snarare ytors polaritets-/apolaritetsegenskaper. CBM:er som finns i olika CAZymer tillskrivs också en målinriktad funktion. De kan förbättra den hydrolytiska aktiviteten hos den katalytiska domän som de är knutna till och leda till ett mer gynnsamt pH- och temperaturoptimum . Deras kolhydratbindande egenskaper kan dessutom utnyttjas för affinitetsrening av fusionsproteiner med hjälp av t.ex. cellulosakolonner . Det breda spektrumet av andra tillämpningar av rekombinanta CBM har nyligen granskats på annat håll.

Trichoderma reesei för konsoliderad bioprocess och helcellskatalys

Konsoliderad bioprocess (CBP) är klassiskt sett integrationen av de cellulolytiska enzymproduktions-, enzymatiska hydrolys- och fermenteringsstegen i en process för framställning av etanol av cellulosa till en enda enhetsoperation. Därför vore det önskvärt med en enda organism med goda cellulolytiska egenskaper och en effektiv etanoljäsningsväg. Användning av mikrobiella konsortier har dock också fått viss uppmärksamhet . Tyvärr finns det för närvarande ingen enskild organism som uppfyller båda kraven (fig. 2). Följaktligen har man försökt att konstruera etanologener så att de blir cellulolytiska eller cellulolytiska organismer så att de blir etanologena. När det gäller det första scenariot har T. reesei ofta fungerat som en CAZyme-gendonator, särskilt för cel5a och cel7b som kodar för två av dess endoglukanaser och för dess två cellobiohydrolaser cel6a och cel7a (tabell 1). I alla publicerade studier har den relativt låga sekretoriska kapaciteten hos S. cerevisiae begränsat substratomvandlingen genom de sekretade eller membranförankrade heterologa CAZymerna. För att uppnå hög etanolavkastning med realistiska cellulosasubstrat krävdes därför komplettering med kommersiella T. reesei enzymcocktails. Samtidigt som man nu arbetar för att förbättra sekretions- och ytvisningskapaciteten hos konstruerade S. cerevisiae-stammar, har de cellulasvisande stammarna som för närvarande finns tillgängliga redan potential att leda till betydande minskningar av den enzymbelastning som krävs för förkalkning av biomassa. Inom ramen för det andra scenariot utgör T. reesei själv en lovande målorganism. Även om denna svamp naturligt har förmågan att metabolisera alla biomassarelaterade sockerarter och omvandla dem till etanol, är avkastningen låg och ättiksyra bildas som en oönskad biprodukt . Å andra sidan är storskaliga fermenteringsregimer för T. reesei väl etablerade på grund av dess breda tillämpning inom kommersiell enzymproduktion, och de molekylära verktygen för dess genteknik är också mycket välutvecklade. En av de återstående stora utmaningarna när det gäller att använda T. reesei som en CBP-organism är att flera av dess cellulaser och glykolytiska gener undertrycks av hypoxi , vilket är nödvändigt för etanolproduktion. Dessutom utgör den transkriptionella repressionen av cellulaser i närvaro av etanol ytterligare en utmaning som måste övervinnas. Den cellulashyperproducerande stammen RUT-C30 har dock en högre etanoltolerans jämfört med stam QM9414 från Natick-linjen och utgör därför en perfekt plattformsstam för att utveckla T. reesei som en CBP-organism, särskilt eftersom den också är kolkatabolitavdämpad. Dessutom uppvisar RUT-C30 i närvaro av en lignocellulosamassa en pelletsliknande morfologi under de tidiga stadierna av fermenteringen , vilket kan uppnås på ett tillväxtoberoende sätt genom tillsats av det ytaktiva ämnet Triton X-100 och som då också leder till en högre enzymproduktion . Detta är viktigt eftersom dålig blandbarhet och låg maximal celltäthet till följd av den trådformiga tillväxten hittills har hindrat användningen av T. reesei som CBP-organism. Mer allmänt sett kan konsoliderad bioprocessing också användas för att beskriva andra integrerade processer där substratet inte nödvändigtvis är lignocellulosabiomassa utan en annan biopolymer, t.ex. kitin eller stärkelse, och där produkten inte är etanol utan någon annan metabolit . I detta syfte har ett antal nyligen genomförda studier syftat till att överproducera olika metaboliter genom att konstruera T. reesei (tabell 2). Den avkastning som kunde uppnås var dock i de flesta fall långt ifrån kommersialisering och krävde därför ytterligare optimering.

Verktyg för celldesign och cellteknik

Vidare två omfattande översikter om den molekylära verktygslådan för T. reesei och andra Trichoderma-arter har givits först nyligen , vi vill uppdatera dessa med de senaste framstegen på området. Målinriktad stamutveckling för förbättrad cellulasproduktion eller för metabolisk ingenjörskonst kräver effektiva metoder för att införa riktade genetiska förändringar i organismen. Den generellt sett låga effektiviteten hos gene targeting har länge varit en stor utmaning när det gäller att få fram ett rimligt antal transformanter genom homolog integration av en deletion eller uttryckskassett. Detta problem har huvudsakligen lösts genom att inaktivera komponenter i DNA-reparationsvägen NHEJ (non-homologous end joining), t.ex. tku70 eller tmus53 . Tku70-deleterade stammar uppvisar förbättrad genmålning, även om effektiviteten av homolog integration i dessa stammar fortfarande kan variera beroende på den målinriktade lokusen och därför kan sjunka till 30 %. På grundval av denna förbättring utvecklades ett antal nya metoder för att infoga uttryckskassetter i en definierad genomisk region och därigenom undvika pleiotropa effekter som orsakas av slumpmässig integrering. Med hjälp av en tku70-bakgrund har Jorgensen et al. utvecklat en uttrycksplattform som använder det lätt screenade ade2-locus som den föredragna platsen för integration. När uttryckskassetten integreras i detta locus förstörs ade2 och de resulterande transformanterna får en distinkt röd pigmentering. I en annan studie valdes lokus pyr4 och asl1 för att utveckla en stam med uridin- och l-arginin-auxotrofi som möjliggör platsstyrd integration på dessa platser. Ouaedraogo et al. följde en annan strategi och uttryckte meganukleaset I-SceI från S. cerevisiae i T. reesei. I-SceI genererar konstgjorda dubbelsträngsbrott vid en I-SceI-igenkänningsplats som i förväg introducerades på ett fördefinierat lokus och förbättrade både transformations- och homolog integrationseffektiviteten. I en uppföljande studie kombinerades I-SceI-medierade dubbelsträngsbrott med en tku70-deletion . Här gynnar oförmågan att reparera dubbelsträngsbrott via NHEJ en integrering av kassetten, vilket leder till homolog rekombinationseffektivitet på upp till 100 %. En revolution för genteknik eller genomredigering introducerades med CRISPR-systemet (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9-systemet . Systemet testades för första gången för filamentösa svampar i T. reesei, vilket understryker både behovet av en sådan teknik och dess ökande betydelse som enzymproducent. Det introducerar specifika DNA-dubbelsträngsbrott för att stimulera genmålsättning och är endast beroende av ett Cas9-nukleas (CRISPR-associerat) som använder ett enda chimäriskt guide-RNA för målsättning. Den exakta inriktningen av detta RNA-ledda Cas9 mot en specifik DNA-sekvens uppnås av protospacer-sekvensen i det ledande RNA:t genom enkel basparning. Genom att använda flankerande regioner på 200 bp uppströms och nedströms för konstruktionen för gendeletion kunde HR-frekvenser på mer än 90 % uppnås. Dubbla deletioner och trippeldeletioner förekom med en frekvens på 45 % respektive 4 % efter en enda transformationsomgång. Medan i den här studien in vitro-transkriberade guide RNA:er samtransformerades med deletionskassetten till en Cas9-uttryckande T. reesei, använde Nødvig et al. två flankerande ribozymssekvenser för att frigöra guide RNA:er från ett större transkript som också kodar för Cas9-enzymet i olika Aspergilli. Ett annat viktigt verktyg som behövs både för att uttrycka rekombinanta proteiner och för att konstruera stammar är promotorer som möjliggör genuttryck på ett kontrollerbart sätt. Även om ett antal inducerbara och repressibla promotorer finns tillgängliga med de olika cellulaspromoterregionerna har de vanligtvis nackdelar eftersom deras uttryck är kopplat till värdmetabolismen och aktivatorer kan vara begränsande på grund av promotorns titreringseffekter. Användbara alternativ är en uppsättning l-methioninrepressiva T. reesei-gener med olika basal uttrycksstyrka . Det visades att en av dessa promotorer kan driva ett repressivt uttryck av olika reportergener på flera kolkällor, inklusive vetehalm. I en liknande studie användes promotorn för en kopparpermeasegen hos T. reesei för att kontrollera uttrycket av den viktigaste regulatorn för cellulas och hemicellulas xyr1 i avsaknad av koppar . Med tanke på att kopparhaltiga enzymer från AA-familj 9 är viktiga komponenter i T. reesei cellulasemixen är det dock tveksamt om detta system kan tillämpas i ett scenario för cellulasproduktion.

Förutom dessa spännande molekylära verktyg finns nu också några äldre knep från den klassiska genetiken. Stamutveckling av T. reesei hindrades länge av att svampen ansågs vara asexuell, vilket förhindrade korsning av stammar. En milstolpe i detta avseende var upptäckten att QM6a har ett MAT1-2 parningstypslocus och lätt kan korsas med vissa MAT1-1 T. reesei vildtypsisolat . Men när QM6as MAT1-2 locus ersattes med dess MAT1-1 motsvarighet bildades inga stromata vid konfrontation med den ursprungliga MAT1-2 QM6a-stammen. Följaktligen var det omöjligt att utnyttja parning för stamutveckling i de olika akademiska och industriella T. reesei-stammarna som härstammar från QM6a. Med hjälp av en systembiologisk metod identifierades den gen som saknas och som är ansvarig för kvinnlig sterilitet som ham5 . I N. crassa kodar ham-5 för ett protein som tjänar som en MAP-kinas-ställning under cellfusionen. Genom att återinföra en funktionell ham5 återställs stromata-bildningen i stam QM6a och återställs den kvinnliga fertiliteten i andra stammar som härstammar från QM6a-bakgrunder . Detta resultat är särskilt viktigt eftersom korsning med de tidigare nämnda H. jecorina-isolaten kan leda till segmentalt aneuploida avkommor . Med detta verktyg i handen har man lagt grunden för att identifiera relevanta mutationer som leder till t.ex. överproduktion av cellulas. Detta är viktigt eftersom traditionella komplementationsmetoder för att identifiera gen(er) som orsakar muterade fenotyper i stort sett har misslyckats i arter som T. reesei. Även om sekvensering med hög kapacitet och jämförande genomanalyser lätt kan identifiera mutationer i QM6a-stammen av cellulasehyper- och -nollproducenter har detta endast i ett fåtal fall lett till att en mutation har kunnat kopplas till en viss fenotyp. Men i de fall då ett stort antal mutationer hittades eller då mutationerna påverkade gener med okänd funktion har den jämförande sekvensanalysen inte avslöjat arten av de önskade målgenerna . Flera forskare har därför framgångsrikt tillämpat bulk-segregationsanalys i kombination med nästa generations sekvensering för att identifiera relevanta mutationer. I detta tillvägagångssätt korsas mutanten med en referensstam och det genomiska DNA:t från de segreganter som uppvisar den önskade fenotypen sammanförs och sekvenseras. Genom att jämföra denna pool av sekvenserat DNA med genomet hos föräldrastammarna kan man sedan avslöja bevarade mutationer som är relevanta för fenotypen. Mutationer som inte är relaterade till fenotypen kommer att vara underrepresenterade. Även om man inte kan förvänta sig att detta tillvägagångssätt kommer att leda till identifiering av en enda mutation, eftersom mutationer som ligger nära den relevanta mutationen vanligen samregistreras, minskas antalet mål för ytterligare undersökningar avsevärt.