Alai

Vakuolärt ATPas (V-ATPas) är en ATP-driven protonpump med flera underenheter som försurar intracellulära vesiklar och extracellulära miljöer och därmed är involverad i ett stort antal biologiska funktioner. I tidigare översikter har V-ATPasets struktur och funktion beskrivits på ett elegant sätt. Här går vi igenom den senaste litteraturen om V-ATPasets funktion och bidrag till olika cellprocesser i normal fysiologi med tonvikt på cancer. Vi presenterar också i detalj regleringen av Notch och andra signalvägar av V-ATPas som avslöjar en hittills mindre känd funktion hos V-ATPas i cellsignalering.

Isoformer av underenheter

Strukturellt sett är V-ATPas en roterande nanomotor som består av flera underenheter, var och en med flera isoformer . Underenheterna är ordnade i två domäner: en perifer V1-domän som ansvarar för ATP-hydrolys och en integral membrandomän VO som fungerar vid protontranslokation. V-ATPasets struktur har bevarats i hög grad i alla eukaryota celler och är involverad i olika funktioner hos olika arter. Hos däggdjur har V1-domänen åtta olika underenheter (A, B, C, D, E, F, G och H) medan VO-domänen består av sex olika underenheter (a, c, c’, c’, c”, d, e) . De olika kraven på försurning i intracellulära vesiklar och i den extracellulära miljön styr V-ATPasets funktion och reglering. För att minska eller öka pumpeffektiviteten kontrollerar V-ATPas kopplingen mellan ATP-hydrolys och protonpumpning. Denna process sker med hjälp av V-ATPasets a-underenhet. På samma sätt är V-ATPasets cell- och fackspecifika inriktning också beroende av isoformerna av ”a”-underenheten. VOa är ett 100 kDa integrerat membranprotein med en N-terminal cytosolisk svans och nio transmembrandomäner. Fyra isoformer av a-subenheten (a1, a2, a3 och a4) har identifierats med olika vesikulär och celltypisk fördelning. VOa1 uttrycks på synaptiska vesiklar och VOa2 uttrycks på intracellulära vesiklar som golgi och tidiga endosomer. VOa3 uttrycks på plasmamembranet hos osteoklaster, medan VOa4 uttrycks på plasmamembranet hos njurarnas interkalerade celler. Vidare är N-terminus av underenhet ”a” ett viktigt motiv som binder V1-domänen till membranet och har också rapporterats vara en unik pH-sensor i lysosomer. Uttrycket och lokaliseringen av isoformen av underenhet ”a” är avgörande för V-ATPasets funktion.

Fysiologisk funktion av V-ATPas

V-ATPaset uttrycks överallt och utför olika biologiska funktioner i celler i de flesta vävnader genom vesikulär, luminal och extracellulär försurning . För att uppnå många cellulära funktioner underlättar V-ATPaset lokaliserad koncentration av protoner i sura vesiklar i de endocytära och exocytära vägarna .

Vesikulär försurning

Endosomer och lysosomer

V-ATPaset är mest känt för sin roll i försurningen av intracellulära vesiklar som endosomer och lysosomer. På endosomernas yta försurar V-ATPas och modulerar därmed viktiga cellulära processer som receptorendocytos och vesikulär trafikering . V-ATPasets försurning av endosomer är avgörande för endocytisk internalisering av receptorligandkomplex. Efter det att signaleringen har inletts frigör det lägre pH-värdet i endosomerna liganden och återför den till plasmamembranet . I lysosomerna bidrar V-ATPaser till att upprätthålla det låga pH-värdet 4,5 och är också viktiga för transporten av nysyntetiserade syrahydrolaser från Golgi till lysosomerna. Vidare är fagosomer och autofagosomer i makrofager respektive tumörceller också beroende av det sura pH som upprätthålls av V-ATPas för aktiviteten hos de nedbrytande enzymerna i dessa kompartment .

Golgi

Sorteringen av det exocytära och endocytära maskineriet börjar vid golgikomplexet. Viktigt är att de flesta proteiner genomgår glykosylering, en viktig posttranslationell modifiering inom golgiapparaten . Mutationer i a2-underenheten av V-ATPas resulterar i cutis laxa, ett autosomalt recessivt rynkigt hudsyndrom där försämrad glykosylering av extracellulära matrixproteiner observeras . Även om V-ATPas har varit genetiskt korrelerat med glykosyleringsdefekt har det exakta förhållandet mellan golgiförsurning och proteinmognad inte undersökts.

Specialized vesicles

V-ATPas är ett viktigt protein som uttrycks i specialiserade kompartment i specifika celltyper. Under neurotransmission tillhandahåller V-ATPas den avgörande protonmotivkraft som är nödvändig för bildandet av synaptiska vesiklar och efterföljande ackumulering av neurotransmittorer . I bukspottkörtelceller är V-ATPas-beroende försurning viktig för exocytos av insulin . V-ATPas styr också fission-fusionsbalansen i vesikulära system genom att interagera med Soluble NSF Attachment protein Receptor (SNARE) och GTPas .

Luminal försurning

V-ATPaser identifierades ursprungligen på intracellulära vesiklar, men betydelsen av plasmamembranens V-ATPaser har vuxit enormt . I epitelcellerna i njurens proximala tubuli upprätthåller V-ATPasets a4-isoform den sura basbalansen och försurningen av urinen (systemisk acidos) . På samma sätt försurar plasmamembranets V-ATPas i de klara cellerna i epididymis det luminalfacket och bidrar till mognad och lagring av spermier . I osteoklaster i benet translokaliseras lysosomalt V-ATPas till plasmamembranet under benresorptionen för att försura lakunerna . Plasmalemmalt V-ATPas är avgörande för funktionen hos interdentala celler i örat, epitelceller i näsan och synen . Dysfunktion av V-ATPas är förknippad med patologiska tillstånd som renal tubulär acidos, dövhet, nedsatt luktsinne och osteoporos. En schematisk beskrivning av V-ATPasets roll i vesikulär och luminal acidifiering visas i figur . 1.

Roll i cancer

Nyligen har plasmamembranets V-ATPas studerats ingående i cancer, där de bidrar till att upprätthålla en alkalisk intracellulär miljö som är gynnsam för tillväxt och en sur extracellulär miljö som är gynnsam för invasion . I tumörer har V-ATPase-uttrycket visat sig vara högre mot den främre kanten av prolifererande cancerceller i bröst-, prostata-, lung-, äggstocks-, lever-, bukspottkörtel-, melanom- och esofaguscancer . Särskilt bröstcancerceller uttrycker V-ATPas på plasmamembranet för att försura det extracellulära utrymmet, och det kvantitativa uttrycket av V-ATPas korrelerar med cellinjens invasivitet och metastatiska potential . Det exakta bidraget från V-ATPas till den växande tumören uppnås genom dess påverkan på de molekylära mekanismer/vägar som diskuteras nedan.

Immunmodulering

Den a2 isoformen av Vacuolärt ATPas (VOa2 eller a2V) har en immunmodulerande roll vid graviditet och cancer. Studier som involverar a2V i reproduktionsbiologi grävde fram en hittills okänd roll för denna molekyl för normal mognad och produktion av spermier utöver embryoimplantering . I tumörmikromiljön polariserar a2V:s N-terminala domän makrofagerna till tumörassocierade makrofager (M2-typ) och stimulerar olika undergrupper av monocyter genom endocytos. Efter dessa resultat visades vidare att a2V-brist i tumörceller förändrar den residenta makrofagpopulationen i tumörens mikromiljö och påverkar tumörtillväxten in vivo . a2V uttrycks på neutrofilernas primära granuler och bidrar till att bibehålla pH-värdet i den exocytära banan under neutrofil aktivering . Behandling av mänskliga neutrofiler med rekombinant N-terminal peptid av a2V (a2NTD) främjar neutrofil migration och polarisering . Tillsammans belyser dessa studier V-ATPasets immunmodulerande roll för att framkalla potenta immunsvar.

Warburg-effekten

Ett kännetecken för cancer är Warburg-effekten där cellerna övergår från oxidativ fosforylering till aerob glykolys . Flera studier pekar på hypotesen att cancerceller är mer beroende av V-ATPas än andra pH-regulatorer som Na+H+-utbytare, bikarbonattransportörer och proton-laktatsymporters för att uppnå ett gynnsamt alkaliskt intracellulärt pH och surt extracellulärt pH . Alkalisering av cytosolen aktiverar glykolysen samtidigt som oxidativ fosforylering undertrycks . Vidare regleras vissa glykolyserelaterade onkogener som Hypoxia Induced Factor (HIF-1) av pH-förändring som induceras av V-ATPas .

Syraproteaser

Följande av extracellulär försurning i tumörer är aktivering av syraproteinaser, som är enzymer som klyver den extracellulära matrisen under tumörinvasionen. Dessa enzymer tillhör klassen av sura proteinaser som kathepsiner , Matrix Metallo Proteinases (MMP) och gelatinaser och är aktiva vid surt pH . Dessutom ökar aktiviteten hos intracellulära enzymer som γ-sekretas, som är aktiva vid surt pH, med ökad aktivitet av V-ATPas i vesiklar . Därefter leder detta till dysreglering av onkogena vägar som Notch.

Läkemedelsresistens och V-ATPashämmare

Förändrat pH i tumörens mikromiljö kan påverka känsligheten för kemoterapeutiska läkemedel . Antracykliner och alkaloider har en pKa på 7-8 och internaliseras till det endosomala facket . Nya uppgifter tyder på att användning av V-ATPashämmare inte bara orsakar förändringar av det cytosoliska pH-värdet som leder till celldöd, utan också förbättrar läkemedelsupptaget, vilket gör dem till en effektiv komponent i kombinationsbehandling av cancer . I äggstockscancer uttrycks a2V i cancercellernas framkant och modulerar MMP9:s aktivitet. Vidare bidrar a2V till cisplatinmedierad läkemedelsresistens i äggstockscancer och selektiv hämning av a2V skulle kunna fungera som en effektiv strategi för att behandla kemoresistent äggstockscancer . V-ATPashämmarna bafilomycin och concanamycin tillhör en klass av pleomakrolider som är inriktade på VO-sektorn och effektivt hämmar V-ATPasaktiviteten. Nyligen har apicularen och archazolider rapporterats vara potenta och specifika hämmare av V-ATPas . Alla tillgängliga småmolekylära hämmare har dock en betydande toxicitet med tanke på V-ATPasets betydelse för normal cellfysiologi . Därför kan utvecklingen av specifika neutraliserande antikroppar mot isoformen av a-underenheten, som har cellspecifikt uttryck, vara ett effektivt alternativ för att orsaka direkt hämning av V-ATPas, samtidigt som multiresistens mot flera olika läkemedel indirekt kan hanteras med hjälp av kombinatorisk användning.

Autofagi

Autofagi är processen för selektiv nedbrytning eller återvinning av last som levereras av autofagosomerna till lysosomerna. Tumörceller visar ett varierande beroende av autofagi när de utvecklas från primärtumör till högmetastatisk solid tumör . Cellulär last som är markerad för nedbrytning levereras till lysosomerna genom autofagiska processer. V-ATPasets protonpumpningsaktivitet är ansvarig för aktivering av lysosomala syrahydrolaser som bryter ned den last som tas upp från autofagosomerna . Även om studier pekar på att det krävs ett funktionellt V-ATPas för autofagi och V-ATPashämmaren Bafilomycin används som en klassisk hämmare av autofagi, är V-ATPasets exakta roll i membranets dynamik i det autofagiska flödet inte klarlagd. I en nyligen genomförd studie rapporterades att behandling med Bafilomycin, som hämmar aktiviteten hos både V-ATPas och Ca2+-pumpen SERCA-pumpen, ledde till blockering av det autofagiska flödet, medan lysosomer med brist på V-ATPas fortfarande kunde fusionera med autofagosomer . Dessa resultat tyder på att V_ATPase är mer involverat i nedbrytning av autofagisk last i lysosomer än i autofagiskt flöde och understryker behovet av att utveckla specifika hämmare och genmanipulationstekniker för att studera V-ATPasets exakta roll i olika viktiga cellprocesser.

Signalering

Den endolysosomala vägen är viktig för både positiv och negativ reglering av signalvägar . Den första kända rapporten om V-ATPasets inblandning i signalering kom från en studie som visade att hämning av V-ATPas med Bafilomycin påverkade internaliseringen av EGFR . Sedan dess har V-ATPas förknippats med signaltransduktion i samband med m-TOR (mammalian Target Of Rapamycin), Wnt, TGF-β och Notch-signalreglering.

Notch-signalering

Den kanske mest välstuderade signalvägen som regleras av V-ATPas är Notch. Detta kan tillskrivas det faktum att Notch-signalering är beroende av den endolysosomala vägen för sin aktivering, underhåll och nedbrytning av viktiga vägmediatorer . V-ATPas upprätthåller den cellulära pH-balansen och spelar en viktig roll för endocytos, proteasaktivering och proteinnedbrytning. Särskilt a2V (V-ATPas-underenhet VOa2) har tidigare lokaliserats till tidiga endosomer – platsen för receptorendocytos . Efter ligandbindning tar Notch-receptorn den endocytära vägen och klyvs av proteaser för aktivering. Senare bryts receptorerna ned i lysosomen. I Drososphila orsakar mutationer i Vps25, en komponent i ESCRT-maskineriet som reglerar endosomal sortering av signalreceptorer, ackumulering av Notch-receptorn i endosomer och förstärker Notch-signalering . I en studie som analyserar drosophila mutationer av Hrs, en annan komponent i ESCRT, ackumuleras Notch i endosomer men orsakar inte ektopisk aktivering av Notch-signalering . Förlusten av autofagi leder till aktivering av Notch-signalering i Drosophila äggstocksfollikelceller på grund av störningar i Notch-nedbrytningen . I motsats till dessa rapporter fann en oberoende studie att mutationer i Rabconnection-3 stör den protonpumpande aktiviteten hos V-ATPas och ackumulerar Notch i sena endosomer efter S2-klyvning, vilket minskar Notch-signaleringen i Drosophila- och däggdjursceller . Dessa fynd följdes av rapporter i Drosophila som ytterligare visar att V-ATPas genom försurning av den endolysosomala vägen krävs för aktivering av Notch i endosomerna och för nedbrytning av Notch i lysosomerna . Under däggdjurs utveckling minskade uttrycket av en dominant negativ underenhet av V-ATPas i neurala prekursorer Notch-signalering och utarmade neurala stamceller, vilket ledde till neuronal differentiering . Nyligen visade studier av astrocyter i näthinnan hos Nuc1-muterade råttor att Notch-signaleringen är dysreglerad. Minskningen av Notch-signalering berodde på muterat βA3/A1-kristallin, som reglerar V-ATPase-aktiviteten vilket resulterar i försämrad endosomal försurning och γ-sekretasaktivitet och därmed påverkar hastigheten på bearbetningen av Notch-receptorerna . Detta är ett intressant resultat med tanke på att V-ATPasets roll i synen nu börjar bli känd. Tillsammans tyder dessa resultat på att regleringen av Notch-signalering genom V-ATPas kan ge både positiva och negativa resultat beroende på vilken cellulär lokalisering av V-ATPasaktiviteten som påverkas (endosomer vs lysosomer) och beroendet av Notch-receptorbearbetningen på den endosomala vägen . Även om V-ATPase och Notch crosstalk har undersökts i samband med att V-ATPase-beroende endolysosomal försurning påverkar Notch-signalering, tyder en färsk rapport på att regleringen också kan vara vice versa. Författarna föreslår att Presinilin1 (PS1), en komponent i γ-sekretasenzymkomplexet som ansvarar för klyvning av Notch-receptorn och β-amyloidpeptid, interagerar fysiskt med VOa1-isoformen av V-ATPas och riktar den från det endoplasmatiska retikulumet till lysosomerna. Våra studier har identifierat att V-ATPas reglerar Notch-signalering vid bröstcancer och utveckling av bröstkörteln . a2V uttrycks på ytan av prolifererande bröstepitelceller och trippelnegativa bröstcancerceller (TNBC), vilket tyder på dess roll i cellproliferation under normal utveckling och sjukdom. I TNBC ökar a2V-hämning Notch-signalering genom att blockera lysosomal och autofagisk nedbrytning av Notch-receptorn . Förlust av a2V i musens bröstkörtel leder till onormal Notch-aktivering och försämrar den duktala morfogenesen, vilket orsakar brister i laktationen . Notch-signalering aktiveras under för tidig förlossning inducerad av infektion med PGN + poly (I:C), vilket resulterar i uppreglering av proinflammatoriska reaktioner, och dess hämning förbättrar in-utero överlevnad av levande foster. Vidare observerades en uppreglering av Notch-relaterad inflammation och en nedreglering av angiogenesfaktorer vid för tidig förlossning inducerad av inflammatorisk reaktion på LPS-injektion . I både infektions- och inflammatoriska förlossningsmodeller kunde vi rädda fenotypen genom att behandla med γ-sekretashämmare (GSI) . Detta banar väg för viktiga framtida inriktningar, särskilt eftersom GSI är en effektiv hämmare av Notch-signalering och för närvarande är föremål för kliniska prövningar för flera cancerformer. Med detta framstår V-ATPas och Notch crosstalk som viktiga under normal utveckling och vid sjukdomar som Alzheimers och olika cancerformer.

Wnt-signalering

Wnt-signalvägen spelar en viktig roll för cell- och vävnadsunderhåll, polaritet och differentiering. Hos människor har dysreglering av Wnt-signalering involverats i cancer . Ett klassiskt exempel på dysreglerad Wnt-signalering är kolorektal cancer där förlusten av Adenomatous Polyposis Coli (APC), en negativ regulator av Wnt-signalering, utlöser tumörigenesen . Under signalering verkar Wnt-ligander på målceller genom att binda till Frizzed, Fz och LRP (low density-lipoprotein), ett receptorkomplex på cellytan som leder till att Glycogen Synthase Kinas (GSK-3) lösgörs och att β-catenin frigörs. β-catenin är den viktigaste nedströmsmediatorn i Wnt-banan, som aktiverade Wnt-mål onkogena gener som c myc och cyclinD1 . (P) RR, Pro Renin Receptor, även kallad ATP6ap2, fungerar som en adaptermolekyl mellan V-ATPas och Wnt-receptorkomplexet LRP 5/6 . I Xenopus och Drosophila har det visats att V-ATPas interagerar med LRP 5/6-receptorkomplexet, och både genetisk knockdown och farmakologisk hämning av V-ATPas stör signaltransduktionen och minskar avsevärt det cellulära svaret på Wnt-signalering . Dessutom har det visats att V-ATPas indirekt reglerar Wnt-signalmediatorn β-catenin och Notch-mediatorn NICD genom autofagi.

TGF-β-signalering

Mutationer i a2V-genen orsakar det autosomalt recessiva Cutis Laxa-syndromet (ACL), där patienterna uppvisar en minskad mängd extracellulära matrisproteiner, t.ex. kollagen, vilket resulterar i en rynkig hudfenotyp. I en mekanistisk undersökning av de mutationer som orsakar cutis laxa hos människor identifierades a2P405L-mutationen som instabil och defekt i golgi-trafiken jämfört med vildtypen, vilket stöder dessa resultat. Vidare pekar rapporter på en glykosyleringsdefekt i ACL som resulterar i en förhöjd signalering av transforming growth factor-beta (TGF-β) hos dessa patienter med a2V-mutationer . V-ATPas främjar TGF-β-inducerad epitel-mesenkymal övergång av proximala tubulära epitelceller från råttor . Förutom dess effekt på Notch-signalering aktiverade a2V-hämning Wnt-banan i TNBC och TGF-β-banan i bröstepitelceller . Detta tyder på att a2V:s roll i moduleringen av signalmediatorer inte är exklusivt för Notch. Vidare uppvisade dessa möss också en minskning av totalt kollagen på grund av försämrad glykosylering .

mTOR-signalering

I mTOR-signalering känner serin-treoninkinaset mTOR och andra komponenter i mTOR-komplexet 1 (mTORC1) av aminosyratillgänglighetens cellulära stress och modulerar tillväxten .Vid aminosyra-stimulering aktiverar V-ATPas Guanine Exchange Factor (GEF)-aktiviteten hos Ragulator mot RagA, vilket i sin tur främjar RagC GTP-hydrolys av RagC . Den GTP-bundna RagA och den GDP-belastade RagC rekryterar tillsammans mTORC1 till lysosomalytan . Aktiverad mTORC1 reagerar på tillväxtfaktorsignalering och kontrollerar den regulatoriska växlingen från celldöd till proliferation . En färsk rapport tyder på att osteoklasternas protonpumpsregulator Atp6v1c1 är inblandad i att öka bröstcancertillväxten genom att aktivera mTORC1-vägen och benmetastasering genom att öka V-ATPase-aktiviteten .

.