Spektroskopiska metoder
Absorbansspektroskopi. För vissa enzymanalyser är det möjligt att mäta reaktanten eller produkten direkt utifrån dess absorbansegenskaper Fersht (1999). I den reaktion som katalyseras av glukos-6-fosfatdehydrogenas (EC 1.1.1.1.49) absorberar en produkt (NADH) ljus vid 340 nm, vilket gör det möjligt att övervaka reaktionen genom att följa ökningen av absorbansen vid denna våglängd
Glukos-6-fosfat + NAD+ → 6-fosfoglukonat + NADH + H+
I andra fall mäts en reaktant eller produkt indirekt. Med acetylkolinesteras (EC 3.1.1.7) används till exempel acetyltiokolin som substrat som frigör tiokolin när det utsätts för enzymet. Tiokolinet reagerar med Ellmans reagens och ger en färgad produkt, vilket gör det möjligt att övervaka reaktionen genom att följa ökningen av absorbansen.
Acetylthiokolin + H2O → acetat + H+ + tiokolin
Thiokolin + Ellmans reagens → färgat derivat
Kopplade analyser används ibland för att övervaka enzymaktiviteten. I detta fall kopplas den intressanta enzymatiska reaktionen ihop med en andra reaktion som är kopplad för bekväm mätning. Ett exempel på detta är analysen av hexokinas (EC 2.7.1.1). I detta fall ingår ett överskott av glukos-6-fosfatdehydrogenas och NAD+ i testblandningen och absorbansen vid 340 nm övervakas.
Reaktion I: Glukos + ATP → glukos-6-fosfat + ADP
Reaktion II: Glukos 6-fosfat + NAD+ → 6-fosoglukonat + NADH + H+
I detta exempel bör reaktion I vara hastighetsbegränsande och koncentrationen av glukos 6-fosfat bör nå ett stabilt tillstånd efter en fördröjningsperiod. Cleland Cleland (1979) formulerade ett förfarande för att säkerställa att den kopplade analysen ger ett korrekt mått på enzymets reaktionshastighet. Om möjligt är det att föredra att övervaka en reaktion kontinuerligt. Med de analyser som beskrivs ovan kan spektrofotometern programmeras så att den ger en kontinuerlig avläsning som en funktion av tiden. I separationstekniker, som kan innefatta användning av radioaktivitet, elektrofores eller kromatografi, används diskontinuerliga eller slutpunktsanalyser. Efter att ha fastställt en linjär tidsperiod för en analys mäts en parameter vid en enda tidpunkt inom den linjära tidsperioden (helst en tidpunkt nära mitten av den linjära fasen). Hastigheten bestäms sedan utifrån skillnaden i signal vid denna tidpunkt och vid inledningen av reaktionen. Försiktighet måste iakttas vid analyser med slutpunkt, och tidsförloppen bör kontrolleras för att bekräfta linjäriteten. Förändringar i inkubationsförhållandena, t.ex. temperatur, pH eller substratkoncentration, kan förändra linjäriteten hos en analys. För rutinmässiga enzymtester innehåller reaktionskärlet alla komponenter utom en, och reaktionen inleds genom att man tillsätter den komponent som saknas (enzymet eller ett av substraten). De övriga komponenterna bör vara balanserade i fråga om pH, temperatur och jonstyrka. Reaktionen inleds vanligen genom att en liten volym av en koncentrerad stamlösning av den saknade komponenten tillsätts. En liten volym garanterar att tillsatsen inte stör de redan etablerade jämviktsförhållandena. När det inte är möjligt att tillsätta en liten komponent bör de separerade komponenterna vara vid samma temperatur, jonstyrka och p H. Även om de två komponenterna måste blandas fullständigt bör kraftig skakning undvikas eftersom det kan denaturera enzymproteinet. Blandningen kan åstadkommas genom att man vänder på ett rör med en fäst propp eller en kuvett med en Parafilmförsegling. Utspädda proteiner är ofta mindre stabila än mer koncentrerade, och analyser utförs ofta i närvaro av ett inert protein, t.ex. bovint serumalbumin (0,25 mg/ml), för att stabilisera det renade enzymet. Försök bör utföras för att säkerställa att proteinet är inert. Eftersom albumin till exempel kan binda till hydrofoba substrat är det kanske inte alltid lämpligt för detta ändamål. För diskontinuerliga analyser kan timern ställas in och proverna sugas upp vid specifika tidsintervall efter blandning. För de flesta spektrofotometrar initieras detektionen manuellt med hjälp av en instrumentpanel eller ett datortangentbord. För att tillsätta en komponent till en kuvett krävs cirka 20 sekunder för att placera kuvetten i en spektrofotometer och påbörja detektering genom att trycka på en datortangent. Denna tid är vanligtvis inte av någon större betydelse eftersom analysen för de flesta reaktioner pågår mellan 10 och 30 minuter. Kontrollmätningarna omfattar ett blanko som inte innehåller enzym och ett blanko som inte innehåller substrat. Sådana kontroller säkerställer att oavsiktliga reaktioner inte inträffar. Kontrollhastigheten (blankprov utan enzym) subtraheras från det datum som genereras av experimentet för att få fram den faktiska hastigheten för den enzymatiska reaktionen. För många analyser är det nödvändigt att stänga av eller stoppa reaktionen vid en viss tidpunkt för att förhindra ytterligare produktion av produkt. Exempelvis kan prover tas med 5 minuters mellanrum under en förutbestämd tidsperiod och produkten mätas med HPLC.
Den kromatografiska analysen kan ta 30 minuter att genomföra. Metoder för att avsluta reaktionen innebär vanligen att enzymet denatureras genom tillsats av syra eller nedsänkning i ett kokande vattenbad. Aktiviteten hos vissa metalloenzymer kan släckas med EDTA eller annan metalljonkadelator. De flesta enzymtester baseras på spektroskopiska tekniker, där de två vanligaste är absorption och fluorescens Fersht (1999). Den våglängd som används för att följa reaktionshastigheten bör vara den som ger den största skillnaden i absorption mellan substratet och produkten. Absorptionsmätningar utförs med en standardspektrofotometer med proverna i specialiserade celler, eller kuvetter. Engångskuvetter av plast som rymmer 1 eller 3 ml prov finns i handeln. Användningen är begränsad till det synliga våglängdsområdet (350-800 nm). Kvartskuvetter måste användas (glas och plast absorberar ljus i UV-området) för mätningar vid våglängder under 350 nm. Kuvetternas banlängder anges av tillverkaren. Populära banlängder är 1,00 cm, 0,40 cm och 0,20 cm. Ett ökande antal analyser utförs med 96-brunns mikrotiterplattor med plast- eller kvartsbottnar. Koncentrationen av ett ämne som absorberar ljus vid specifika våglängder kan bestämmas med hjälp av Beers lag:
A = εcl,
där A är provets absorbans vid en specificerad våglängd, c är provets koncentration, l är banlängden och ε är extinktionskoefficienten, eller molär absorptivitet. ε har enheterna M-1 cm-1 eller mM-1 cm-1. Om värdet av ε är känt för ett visst ämne är det möjligt att beräkna koncentrationen av detta ämne i en lösning genom att mäta dess absorption i lösningen. Med hjälp av Beers lag är det möjligt att beräkna koncentrationens förändringshastighet under en reaktion. Ett potentiellt fel vid användning av absorptionsmätningar beror på en avvikelse från Beers lag eftersom den endast gäller för ett begränsat intervall av absorptionsvärden. Eftersom den kanske inte kan tillämpas på absorptionsvärden som är större än 1, bör testerna utformas så att de experimentella värdena är lägre än så. Det kan vara möjligt att kringgå vissa av dessa problem genom att använda kuvetter med kortare banlängder. Ett prov med en absorbans på 1,00 i en kupa med en banlängd på 1,00 cm kommer att ha en absorbans på 0,20 i en kupa med en banlängd på 0,20 cm. Att arbeta med en absorbans på omkring 0,5 är i allmänhet en kompromiss mellan att minimera det optiska bruset i en spektrofotometer och att ha en rimlig signal att mäta. Turbiditeten i en lösning kan sprida ljuset och ge skenbar absorbans. Filtrering eller centrifugering kan användas för att avlägsna dessa partiklar. Även om ändringar i banlängden kan kringgå vissa avvikelser från linjäritet (dvs. när absorbansen är så hög att spektrofotometern inte kan göra en exakt mätning), beror avvikelserna ofta på intermolekylära interaktioner mellan de absorberande arterna. Dimerisering (eller bildning av eximerer av högre ordning) sker vid högre koncentrationer av de absorberande arterna. I dessa fall kommer Beers lag att följas om koncentrationen av produkten minskas. Detta kan åstadkommas antingen genom att bromsa reaktionen (genom att minska enzymkoncentrationen) eller genom att göra mätningar under en kortare tidsperiod (innan avvikelser från Beers lag uppstår).