Coronavirus har orsakat två storskaliga pandemier under de senaste två decennierna, SARS och Mellanösterns respiratoriska syndrom (MERS)8,9. Man har i allmänhet trott att SARSr-CoV – som huvudsakligen finns hos fladdermöss – skulle kunna orsaka ett framtida sjukdomsutbrott10,11. Här rapporterar vi om en serie fall orsakade av ett oidentifierat utbrott av en lunginflammationssjukdom i Wuhan, Hubeiprovinsen i centrala Kina. Sjukdomsutbrottet, som startade på en lokal fisk- och skaldjursmarknad, har vuxit kraftigt och smittat 2 761 personer i Kina, är förknippat med 80 dödsfall och har lett till att 33 personer smittats i ytterligare 10 länder den 26 januari 202012. Typiska kliniska symtom hos dessa patienter är feber, torrhosta, andningssvårigheter (dyspné), huvudvärk och lunginflammation. Sjukdomen kan leda till progressiv andningssvikt på grund av skador på alveolerna (vilket observeras med hjälp av datortomografiska bilder från bröstkorgen) och till och med till döden. Sjukdomen fastställdes av kliniker som orsakad av virusinducerad lunginflammation enligt kliniska symtom och andra kriterier, inklusive en höjning av kroppstemperaturen, minskning av antalet lymfocyter och vita blodkroppar (även om nivåerna av de sistnämnda ibland var normala), nya lunginfiltrat på lungröntgen och ingen uppenbar förbättring efter behandling med antibiotika i tre dagar. Det verkar som om de flesta av de första fallen hade kontakt med den ursprungliga fisk- och skaldjursmarknaden, men sjukdomen har nu utvecklats till att överföras genom kontakt mellan människor.
Prover från sju patienter med allvarlig lunginflammation (varav sex är säljare eller budbärare från fisk- och skaldjursmarknaden), som togs in på intensivvårdsavdelningen på Wuhan Jin Yin-Tan-sjukhuset i början av utbrottet, skickades till laboratoriet vid Wuhan Institute of Virology (WIV) för diagnostisering av den orsakande patogenen (Extended Data Table 1). Som ett laboratorium som undersöker CoV använde vi först pan-CoV PCR-primers för att testa dessa prover13 , med tanke på att utbrottet inträffade på vintern och på en marknad – samma miljö som SARS-infektioner. Vi fann fem prover som var PCR-positiva för CoV. Ett prov (WIV04), som samlades in från bronkoalveolär lavagevätska (BALF), analyserades genom metagenomisk analys med hjälp av nästa generations sekvensering för att identifiera potentiella etiologiska agens. Av de 10 038 758 totala läsningarna – varav 1 582 totala läsningar behölls efter filtrering av läsningar från det mänskliga genomet – stämde 1 378 (87,1 %) sekvenser överens med sekvensen av SARSr-CoV (fig. 1a). Genom de novo-sammansättning och riktad PCR erhöll vi ett 29 891 baspar CoV-genom som hade 79,6 % sekvensidentitet med SARS-CoV BJ01 (GenBank-anslutningsnummer AY278488.2). Hög genomtäckning uppnåddes genom att återföra de totala läsningarna till detta genom (Extended Data Fig. 1). Denna sekvens har lämnats in till GISAID (https://www.gisaid.org/) (accession nummer EPI_ISL_402124). I enlighet med det namn som Världshälsoorganisationen (WHO) har gett den, kallar vi den preliminärt för nytt coronavirus 2019 (2019-nCoV). Ytterligare fyra fullständiga genomsekvenser av 2019-nCoV (WIV02, WIV05, WIV06 och WIV07) (GISAID-anslutningsnummer EPI_ISL_402127-402130) som var mer än 99,9 % identiska med varandra erhölls därefter från ytterligare fyra patienter med hjälp av nästa generations sekvensering och PCR (Extended Data Table 2).
a, Metagenomisk analys av nästa generations sekvensering av BALF från patienten ICU06. b, Genomisk organisation av 2019-nCoV WIV04. M, membran. c, Likhetsdiagram baserat på den fullständiga genomsekvensen av 2019-nCoV WIV04. Fullständiga genomsekvenser av SARS-CoV BJ01, fladdermus SARSr-CoV WIV1, fladdermuscoronavirus RaTG13 och ZC45 användes som referenssekvenser. d, fylogenetiskt träd baserat på nukleotidsekvenser av fullständiga genomer av coronavirus. MHV, murint hepatitvirus, PEDV, svin epidemiskt diarrévirus, TGEV, svin smittsamt gastroenteritvirus. 0,1 substitutioner per nukleotidposition. Beskrivningar av inställningar och programvara som användes finns i Metoder.
Virusgenomet består av sex större öppna läsramar (ORF) som är gemensamma för coronavirus och ett antal andra accessoriska gener (Fig. 1b). Ytterligare analyser visar att vissa av 2019-nCoV:s gener hade mindre än 80 % nukleotidsekvensidentitet med SARS-CoV. Aminosyresekvenserna för de sju bevarade replikasdomänerna i ORF1ab som användes för klassificering av CoV-arter var dock 94,4 % identiska mellan 2019-nCoV och SARS-CoV, vilket tyder på att de två virusen tillhör samma art, SARSr-CoV.
Vi fann sedan att en kort region av RNA-beroende RNA-polymeras (RdRp) från ett fladdermuscoronavirus (BatCoV RaTG13) – som tidigare upptäckts hos Rhinolophus affinis från Yunnan-provinsen – uppvisade hög sekvensidentitet med 2019-nCoV. Vi utförde sekvensering med full längd på detta RNA-prov (GISAID-anslutningsnummer EPI_ISL_402131). Simplot-analysen visade att 2019-nCoV var mycket lik RaTG13 i hela genomet (fig. 1c), med en total genomsekvensidentitet på 96,2 %. Med hjälp av de anpassade genomsekvenserna av 2019-nCoV, RaTG13, SARS-CoV och tidigare rapporterade SARSr-CoV från fladdermöss upptäcktes inga tecken på rekombinationshändelser i 2019-nCoV:s genom. Fylogenetisk analys av det fullständiga genomet och gensekvenserna för RdRp och spike (S) visade att – för alla sekvenser – RaTG13 är den närmaste släktingen till 2019-nCoV och de bildar en distinkt släktlinje från andra SARSr-CoV (fig. 1d och Extended Data fig. 2). Det receptorbindande spikprotein som kodas av S-genen var mycket avvikande från andra CoVs (Extended Data Fig. 2), med mindre än 75 % nukleotidsekvensidentitet med alla tidigare beskrivna SARSr-CoVs, med undantag för en 93,1 % nukleotididentitet med RaTG13 (Extended Data Table 3). S-generna hos 2019-nCoV och RaTG13 är längre än andra SARSr-CoV. De största skillnaderna i sekvensen av S-genen hos 2019-nCoV är de tre korta insatserna i den N-terminala domänen samt förändringar i fyra av fem nyckelrester i det receptorbindande motivet jämfört med sekvensen hos SARS-CoV (Extended Data Fig. 3). Huruvida insatserna i den N-terminala domänen av S-proteinet i 2019-nCoV ger sialinsyrabindande aktivitet på samma sätt som i MERS-CoV måste studeras ytterligare. Det nära fylogenetiska släktskapet med RaTG13 ger belägg för att 2019-nCoV kan ha sitt ursprung i fladdermöss.
Vi utvecklade snabbt en qPCR-baserad detektionsmetod på grundval av sekvensen av S-genens receptorbindande domän, som var den mest variabla regionen i genomet (fig. 1c). Våra data visar att primrarna kunde skilja 2019-nCoV från alla andra humana coronavirus, inklusive fladdermus SARSr-CoV WIV1, som delar 95 % identitet med SARS-CoV (Extended Data Fig. 4a, b). Av de prover som erhölls från de sju patienterna fann vi att sex BALF- och fem munsvabbprover var positiva för 2019-nCoV under den första provtagningen, vilket bedömdes med qPCR och konventionell PCR. Vi kunde dock inte längre påvisa viruspositiva prover i orala svabbar, analsvabbar och blodprover som togs från dessa patienter under den andra provtagningen (fig. 2a). Vi rekommenderar dock att andra qPCR-mål, inklusive RdRp- eller envelope (E)-generna, används för rutinmässig detektion av 2019-nCoV. På grundval av dessa resultat föreslår vi att sjukdomen kan överföras genom luftburen överföring, även om vi inte kan utesluta andra möjliga överföringsvägar, eftersom ytterligare undersökningar, inklusive fler patienter, krävs.
a, Molekylär detektion av 2019-nCoV hos sju patienter. Patientinformation finns i de utökade datatabellerna 1 och 2. Detektionsmetoderna beskrivs i metoderna. AS, analsvabb; OS, munsvabb. b, Dynamik av 2019-nCoV-antikroppsnivåer hos en patient som visade sjukdomstecken den 23 december 2019 (ICU-06). OD-kvot, optisk densitet vid 450-630 nm. Den högra och vänstra y-axeln anger ELISA OD-förhållanden för IgM respektive IgG. c, Serologiskt test av 2019-nCoV-antikroppar hos fem patienter (Extended Data Table 2). Asterisken anger data som samlades in från patient ICU-06 den 10 januari 2020. b, c, Cut-off var till 0,2 för IgM-analysen och till 0,3 för IgG-analysen, i enlighet med nivåerna hos friska kontroller.
För serologisk detektion av 2019-nCoV använde vi ett tidigare utvecklat nukleokapsidprotein (N-protein) från fladdermus SARSr-CoV Rp3 som antigen för IgG- och IgM-enzymbundna immunosorbentanalyser (ELISA), eftersom detta protein delade 92 % aminosyraidentitet med N-protein från 2019-nCoV (Extended Data Fig. 5) och visade ingen korsreaktivitet mot andra humana coronavirus utom SARSr-CoV7. Vi kunde endast få fem serumprover från de sju patienterna med virusinfektioner. Vi övervakade nivåerna av virala antikroppar hos en patient (ICU-06) 7, 8, 9 och 18 dagar efter sjukdomsdebuten (Extended Data Table 2). En tydlig trend observerades i IgG- och IgM-titerna, som ökade med tiden, förutom att IgM-titern minskade i det sista provet (fig. 2b). Som en andra analys testade vi prover från 5 av de 7 viruspositiva patienterna cirka 20 dagar efter sjukdomsdebuten för att undersöka förekomsten av virusantikroppar (utökade datatabeller 1, 2). Alla patientprover – men inte prover från friska individer – var starkt positiva för virala IgG (fig. 2b). Det fanns också tre IgM-positiva prover, vilket tyder på en akut infektion.
Nästan lyckades vi framgångsrikt isolera viruset (kallat 2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019) från både Vero E6- och Huh7-celler med hjälp av BALF-provet från patient ICU-06. Tydliga cytopatogena effekter observerades i cellerna efter inkubation i tre dagar (Extended Data Fig. 6a, b). Stammen WIV04:s identitet verifierades i Vero E6-celler genom immunofluorescensmikroskopi med hjälp av den korsreaktiva virala N-antikroppen (Extended Data Fig. 6c, d) och genom metagenomisk sekvensering, där de flesta av läsningarna kartlades till 2019-nCoV, och qPCR-analysen visade att virusbelastningen ökade från dag 1 till dag 3 (Extended Data Fig. 6e, f). Viruspartiklar i ultratunna sektioner av infekterade celler uppvisade en typisk coronavirusmorfologi, vilket visualiserades med elektronmikroskopi (Extended Data Fig. 6g). För att ytterligare bekräfta neutraliseringsaktiviteten hos de virala IgG-positiva proverna utförde vi serumneutraliseringsanalyser i Vero E6-celler med hjälp av de fem patientsera som var IgG-positiva. Vi visar att alla prover kunde neutralisera 100 TCID50 (50 % vävnadskultur-infektionsdos) av 2019-nCoV vid en utspädning på 1:40-1:80. Vi visar också att detta virus kunde korsneutraliseras av anti-SARS-CoV-serum från häst (gåva från L.-F. Wang) vid en utspädning på 1:40. Potentialen för korsreaktivitet med SARS-CoV-antikroppar måste dock bekräftas med anti-SARS-CoV-serum från människor (utökad datatabell 4).
ACE2 är känd som en cellreceptor för SARS-CoV14. För att fastställa om 2019-nCoV också använder ACE2 som en cellulär inträdesreceptor utförde vi studier av virusets infektionsförmåga med HeLa-celler som uttryckte eller inte uttryckte ACE2-proteiner från människor, kinesiska hästskofladdermöss, civila djur, grisar och möss. Vi visar att 2019-nCoV kan använda alla ACE2-proteiner, utom musens ACE2, som inträdesreceptor för att komma in i ACE2-uttryckande celler, men inte i celler som inte uttryckte ACE2, vilket tyder på att ACE2 troligen är den cellreceptor genom vilken 2019-nCoV kommer in i cellerna (Fig. 3). Vi visar också att 2019-nCoV inte använder andra coronavirusreceptorer, såsom aminopeptidas N (APN) och dipeptidylpeptidas 4 (DPP4) (Extended Data Fig. 7).
Bestämning av virusets infektionsförmåga i HeLa-celler som uttryckte eller inte uttryckte (otransfekterat) ACE2. Uttrycket av ACE2-plasmid med S-tagg påvisades med hjälp av en monoklonal antikropp mot musens S-tagg. hACE2, human ACE2; bACE2, ACE2 från Rhinolophus sinicus (fladdermus); cACE2, civet ACE2; sACE2, swine ACE2 (gris); mACE2, mus ACE2. Grönt: ACE2, rött: virusprotein (N), blått: DAPI (kärnor). Skalstreck, 10 μm.
Studien ger en detaljerad rapport om 2019-nCoV, det troliga etiologiska agenset som är ansvarigt för den pågående epidemin av akut respiratoriskt syndrom i Kina och andra länder. Virusspecifik nukleotid-positiv och virusprotein-serokonversion observerades hos alla testade patienter och ger belägg för ett samband mellan sjukdomen och förekomsten av detta virus. Det finns dock fortfarande många brådskande frågor som måste besvaras. Sambandet mellan 2019-nCoV och sjukdomen har inte verifierats genom djurförsök för att uppfylla Kochs postulat för att fastställa ett orsakssamband mellan en mikroorganism och en sjukdom. Vi känner ännu inte till virusets överföringsrutiner bland värdarna. Det verkar som om viruset blir mer överförbart mellan människor. Vi bör noga övervaka om viruset fortsätter att utvecklas för att bli mer virulent. På grund av bristen på specifika behandlingar och med tanke på 2019-nCoV:s släktskap med SARS-CoV skulle vissa läkemedel och prekliniska vacciner mot SARS-CoV förmodligen kunna användas för att behandla detta virus. Med tanke på den stora spridningen av SARSr-CoV i deras naturliga reservoarer bör framtida forskning inriktas på aktiv övervakning av dessa virus i större geografiska områden. På lång sikt bör man förbereda antivirala läkemedel och vacciner med brett spektrum för nya infektionssjukdomar som orsakas av detta kluster av virus i framtiden. Viktigast av allt är att strikta regler mot domesticering och konsumtion av vilda djur bör införas.
Note added in proof: Sedan denna artikel godkändes har ICTV betecknat viruset som SARS-CoV-215. Dessutom har WHO offentliggjort det officiella namnet på den sjukdom som orsakas av detta virus, nämligen COVID-1916.
.