Virala stammar
HCoV-229E (VR-740) och HCoV-OC43 (VR-1558) förökades i mänskliga diploida lungfibroblaster MRC-5 (CCL-171) och WI-38 (CCL-75), (alla från ATCC, Manassas, VA). Båda de mänskliga cellinjerna odlades i MEM kompletterat med 10 % fetalt boskapsserum (FBS), 2 mM L-alanyl-L-glutamin, 100 U/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA). Virusinfektionsmediet bestod av MEM eller RPMI-1640 plus 2 % värmeinaktiverad FBS för HCoV-229E respektive HCoV-OC43. Virusstammarna förökades genom inokulering av kolvar som innehöll 24 timmar gamla värdceller som var 80-90 % konfluenta. Efter en timmes inkubation tvättades cellmonolaget och inkuberades i färskt infektionsmedium i tre eller fyra dagar vid 35 °C för HCoV-229E och vid 33 °C för HCoV-OC43. Supernatanten som innehöll den fungerande virusstocken samlades sedan upp genom centrifugering (300 g i 15 minuter). Virustitern bestämdes med 50 % vävnadskulturinfektionsdos TCID50 genom att bedöma cytopatiska effekter (CPE), som poängsattes i ett ljusfältsmikroskop (10×) som vakuolisering av cytoplasma, cellrundning och avskalning.
Bänkskåp för aerosolbestrålning
Ett dynamiskt aerosol/virusbestrålningskammare med ett enda pass användes för att generera, exponera och samla in aerosolprover enligt tidigare beskrivning23. Virala aerosoler genererades genom att en viruslösning tillsattes i en nebulisator för respiratorisk terapi med förlängd aerosol med hög effekt (Westmed, Tucson, AZ) och användes med hjälp av en luftpump med ett ingående flöde på 11 L/min. Viruset flödade in i kammaren och blandades med torr och fuktad luft för att upprätthålla en luftfuktighet på cirka 50-70 %. Den relativa luftfuktigheten, temperaturen och aerosolpartiklarnas storleksfördelning övervakades under hela driften. Aerosolen exponerades för långt-UVC-ljus och samlades slutligen in med hjälp av en BioSampler (SKC Inc., Eighty Four, PA).
Den långt-UVC-lampan placerades cirka 22 cm från UV-exponeringskammaren och riktades mot det 26 cm × 25,6 cm × 254 μm UV-transmitterande plastfönstret (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Florence, KY). I enlighet med våra tidigare experiment med denna kammare23 var flödeshastigheten genom systemet 12,5 L/min. Volymen av UV-exponeringsområdet var 4,2 l, så varje aerosol exponerades i ungefär 20 sekunder när den passerade genom fönstret. Hela bestrålningskammaren var innesluten i ett skåp med biosäkerhetsnivå 2 och alla luftin- och utgångar var utrustade med HEPA-filter (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) för att förhindra att oönskade föroreningar kom in i eller ut ur systemet.
Bestrålningskammarens prestanda
Den specialanpassade bestrålningskammaren simulerade överföringen av aerosoliserade virus som produceras via människors hosta och andning. Kammaren fungerade vid en genomsnittlig relativ fuktighet på 66 % och en genomsnittlig temperatur på 24 °C under alla körningar. Den genomsnittliga partikelstorleksfördelningen var 83 % mellan 0,3 μm och 0,5 μm, 12 % mellan 0,5 μm och 0,7 μm och 5 % >0,7 μm (tabell 3). Aerosoliserade virus överfördes effektivt genom systemet, vilket framgår av kontrollen (nollexponering) som visade tydlig virusintegration (fig. 2 och 3, övre vänstra paneler).
Far-UVC-lampa och dosimetri
Den far-UVC-källa som användes i den här studien var en 12 W 222-nm KrCl excimerlampa-modul med 222-nm som tillverkades av USHIO America (Item #9101711, Cypress, CA). Lampan är utrustad med ett egenutvecklat optiskt filterfönster för att minska lampans emissioner utanför KrCl-emissionstoppen på 222 nm. Lampan placerades 22 cm från fönstret i exponeringskammaren och riktades mot fönstrets mitt. Mätningar av optisk effekt utfördes med hjälp av en 818-UV/DB UV-förstärkt kiselfotodetektor med låg effekt och en 843-R optisk effektmätare (Newport, Irvine, CA). Dosimetri utfördes innan ett experiment påbörjades för att mäta fluensen i kammaren vid aerosolens position.
Avståndet mellan lampan och bestrålningskammaren gjorde det möjligt för en enda lampa att bestråla hela exponeringsfönstrets yta på ett enhetligt sätt. Mätningar med hjälp av kiselfotodetektorn visade på en exponeringsintensitet på cirka 90 μW/cm2 över hela exponeringsområdet. Kammaren är utrustad med en reflekterande aluminiumyta mittemot exponeringsfönstret. Liksom i vårt tidigare arbete med denna kammare23 var reflektiviteten på denna yta cirka 15 %. Vi har därför försiktigt uppskattat intensiteten över hela exponeringsområdet till 100 μW/cm2. Med lampan placerad 22 cm från fönstret och med tanke på de 20 sekunder som en aerosolpartikel behöver för att passera exponeringsfönstret, beräknade vi den totala exponeringsdosen för en partikel till 2 mJ/cm2. Vi använde ytterligare ark av UV-genomsläppliga plastfönster för att jämnt minska intensiteten över exponeringsområdet och skapa olika exponeringsförhållanden. I vårt tidigare arbete med dessa ark uppmätte vi en transmission som låg närmare 65 %23 , men för dessa tester uppmätte vi 222-nm-transmissionen för varje ark till cirka 50 %. Denna minskning av transmissionen beror troligen på plastens nedbrytning med tiden4. Genom att lägga till en eller två plastskivor som täcker exponeringsfönstret minskar exponeringsdosen till 1 respektive 0,5 mJ/cm2.
Experimentellt protokoll
Som tidigare beskrivits23 bestod viruslösningen i nebulisatorn av 1 ml Modified Eagle’s Medium (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY) som innehöll 107-108 TCID50 av coronavirus, 20 ml avjoniserat vatten och 0,05 ml Hank’s Balanced Salt Solution with calcium and magnesium (HBSS++). Bestrålningskammaren användes med aerosoliserade viruspartiklar som flödade genom kammaren och bypass-kanalen i 5 minuter före varje provtagning för att etablera det önskade RH-värdet. Provtagningen inleddes genom att ändra luftflödet från bypass-kanalen till BioSampler med hjälp av en uppsättning trevägsventiler. BioSampler fylldes inledningsvis med 20 ml HBSS++ för att fånga upp aerosolen. Under varje provtagningstillfälle, som varade i 30 minuter, exponerades insidan av bestrålningskammaren för 222 nm långt-UVC-ljus som kom in genom plastfönstret. Variation av den dos av långt-UVC-strålning som levereras till aerosolpartiklarna uppnåddes genom att ytterligare UV-transparenta plastfilmer sattes in enligt beskrivningen ovan, vilket gav de tre testdoserna 0,5, 1,0 och 2,0 mJ/cm2. Kontrollstudier med nolldos genomfördes med excimerlampan avstängd. När provtagningsperioden var avslutad användes lösningen från BioSampler för virusinfektionsanalyserna.
Virusinfektionsanalyser
TCID50
Vi använde oss av analysen med 50 % infektiös dos från vävnadskulturer för att bestämma virusinfektionsförmågan28. Kortfattat plattades 105 värdceller ut i varje brunn i 96-brunnsplattor dagen före försöket. Cellerna tvättades två gånger i HBSS++ och seriella 1:10-spädningar i infektionsmedium av det exponerade viruset från BioSampler överlagrades på cellerna i två timmar. Cellerna tvättades sedan två gånger i HBSS++, täcktes med färskt infektionsmedium och inkuberades i tre eller fyra dagar vid 34 °C. Cytopatiska effekter (CPE) noterades i ett ljusfältsmikroskop (10×) som vakuolisering av cytoplasma, cellrundning och avskalning. TCID50 beräknades med Reed och Muench-metoden28,38. För att bekräfta CPE-poängen fixerades proverna i 100 % metanol i fem minuter och färgades med 0,1 % kristallviolett. Resultaten rapporteras som uppskattning av plackbildande enheter (PFU)/ml med hjälp av konverteringen PFU/ml = 0,7 TCID50 genom att tillämpa Poissonfördelningen29.
Immunofluorescens
För att bedöma om ökande doser av 222-nm-ljus reducerade antalet infekterade celler utförde vi ett standardprotokoll för fluorescerande immunfärgning för att detektera ett viralt antigen i de humana värdcellerna23. Kortfattat plattades 2 × 105 värdceller (MRC-5-celler för HCoV-229E och WI-38 för HCoV-OC43) i varje brunn i 48-brunnsplattor dagen före experimentet. Efter att ha körts genom bestrålningskammaren i 30 minuter överlagrades 150 μl virussuspension som samlats in från BioSampler på monolaget av värdceller. Cellerna inkuberades med viruset i en timme, tvättades sedan tre gånger med HBSS++ och inkuberades sedan över natten i nytt infektionsmedium. Infekterade celler fixerades sedan i 100 % iskall metanol vid 4 °C i 5 minuter och märktes med anti-humant coronavirus spikglykoprotein (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) 1:200 i HBSS++ innehållande 1 % bovint serumalbumin (BSA; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) i rumstemperatur i en timme med försiktig skakning. Cellerna tvättades tre gånger i HBSS++ och märktes med getantimus Alexa Fluor-488 (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 i HBSS++ innehållande 1 % BSA, i rumstemperatur i 30 minuter i mörkret med försiktig skakning. Efter tre tvättar i HBSS++ färgades cellerna med Vectashield innehållande DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindol) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) och observerades med 10×-objektivet i ett Olympus IX70-fluorescensmikroskop som var utrustat med en Photometrics PVCAM högupplöst, högeffektiv digitalkamera och programvaran Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD). För varje 222-nm-dos och virusgenus upprepades de representativa resultaten två gånger. För varje prov förvärvades upp till tio synfält av sammanslagna DAPI- och Alexa Fluor-488-bilder.
Dataanalys
Den överlevande fraktionen (S) av viruset beräknades genom att dividera fraktionen PFU/ml vid varje UV-dos (PFUUV) med fraktionen vid nolldos (PFUcontrols): S = PFUUV/PFUcontrols. Överlevnadsvärdena beräknades för varje upprepat experiment och transformerades i naturlig log (ln) för att få felfördelningen att närma sig normalfördelningen39. Robust linjär regression med hjälp av IWLS (iterated re-weighted least squares)40,41 utfördes i programvaran R 3.6.2 med dessa normaliserade ln-värden som beroende variabel och UV-dos (D, mJ/cm2) som oberoende variabel. Med detta tillvägagångssätt beskrevs virusets överlevnad genom kinetik av första ordningen enligt ekvationen4:
där k är UV-inaktiveringshastighetskonstanten eller känslighetsfaktorn (cm2/mJ). Regressionen utfördes med intercepttermen satt till noll, vilket motsvarar definitionen av 100 % relativ överlevnad vid noll UV-dos, separat för varje studerad virusstam. Data vid nolldos, som per definition representerar ln = 0, ingick inte i regressionen. Osäkerheterna (95 % konfidensintervall, CI) för k-parametern för varje virusstam uppskattades genom bootstrapping för varje regressionsmetod, eftersom bootstrapping kan resultera i mer realistiska osäkerhetsuppskattningar, jämfört med den analytiska standardapproximation som bygger på asymptotisk normalitet, i små datamängder som de som använts här (n = 3 HCoV-229E och n = 4 för HCoV-OC43). Anpassningen bedömdes med hjälp av bestämningskoefficienten (R2). Analys av residualer för autokorrelation och heteroskedasticitet utfördes med hjälp av Durbin-Watson-testet42 och Breusch-Pagan-testet (implementerat i R-paketet lmtest)43. Parameterskattningar (k) för varje virusstam jämfördes med varandra på grundval av 95 % CIs och direkt genom t-test, med hjälp av urvalsstorlekar, k-värden och deras standardfel. Tvärsnittet för virusinaktivering, D90, som är den UV-dos som inaktiverar 90 % av det exponerade viruset, beräknades som D90 = – ln/k. Andra D-värden beräknades på samma sätt.