För det här blogginlägget (mer kommer att följa om de olika typerna av fixeringsmedel…) kommer vi främst att fokusera på användningen av paraformaldehyd/formaldehyd, vanligen kallad PFA, som är det vanligaste fixeringsmedlet inom flödescytometri. PFA hänvisar specifikt till den fasta, polymera formen av formaldehyd (och löses upp till monomer formaldehyd i vattenlösning), så det som vanligtvis kallas kanoniskt för ”PFA-fixering” är i själva verket användning av den monomera, formaldehydlösningen. I detta fall är PFA och formaldehyd synonyma och utbytbara.
En lösning på 1-4 % PFA används vanligtvis för fixering av prover för flödescytometri. När det gäller sanering av infektiösa prover kan koncentrationer så låga som 0,37 % effektivt desinficera prover från hiv-infekterade patienter1. Inkubation i upp till 45-60 minuter med 1 % PFA och 15-20 minuter med 4 % PFA (t.ex. BioLegends buffert) är tillräckligt för att helt fixera cellerna, och cellerna kan antingen användas för behandling i efterföljande led (permeabilisering för intracellulära mål) eller förvaras för framtida analys i detta skede.
Under en rutinmässig flödescytometri-färgningsprocedur som innefattar färgning av ytmarkörer finns det flera steg där du kan besluta att fixera dina prover – fixera efter färgning av ytmarkörer eller fixera före.
I vissa fall är beslutet om när du kan fixera… fixerat. Om du till exempel analyserar fosfomål kan antikroppar som binder vissa ytantigen till antikroppar förändra intracellulära signalvägar kort efter kontakt, vilket leder till en artefakt i dina fosforyleringsresultat. I så fall bör du fixera cellerna innan du tillsätter ytantikropparna (vilket är anledningen till att vårt rekommenderade protokoll att använda för vår True-Phos™ Perm-buffert för att analysera intracellulära fosforyleringsmål är utformat så att fixeringssteget föregår andra förfaranden). Var och en har sina egna fördelar och nackdelar, men här är ett par saker att se upp för i varje fall.