Genoms organisation och uttryck
Genomiskt RNA från luteovirider innehåller fem till sju bevarade ORF:er (fig. 3). ORF:erna 1, 2, 3 och 5 är gemensamma för alla medlemmar av Luteoviridae. Luteovirus saknar ORF0. Enamovirus saknar ORF4. Luteo- och polerovirusgenomerna innehåller en liten ORF (ORF3a) uppströms från ORF3. Luteovirusgenom innehåller en liten ORF (ORF6) nedströms från ORF5. PLRV-genomet innehåller ORF 6 och 7 inom ORF5 och ORF8 inom ORF1. I enamo- och polerovirusen överlappar ORF0 ORF1 med mer än 600 nt, som också överlappar ORF2 med mer än 600 nt. I luteovirusen överlappar ORF1 ORF2 med mindre än 50 nt. I de flesta genomsekvenser av luteo- och polerovirus finns ORF4 helt och hållet inom ORF3. Ett enda termineringskodon inom ramarna för amber (UAG) skiljer ORF5 från ORF3.
Fig. 3. Kartor över virusgenomerna hos släkten i familjen Luteoviridae. Enskilda ORF:er visas med öppna rutor. ORF:erna är förskjutna vertikalt för att visa de olika läsramar som upptas av varje ORF. De gula rutorna visar proteinprodukter med de förutspådda storlekarna angivna till höger om varje ruta. De polyproteiner som kodas av ORF1 hos enamo- och polerovirus innehåller proteaset och det genombundna proteinet (VPg). De predikterade aminosyrasekvenserna för proteiner som kodas av ORF2 liknar RNA-beroende RNA-polymeraser. ORF3, som kodar för det viktigaste pälsproteinet, separeras från ORF5 av en bärnstensfärgad termineringskodon. ORF4, när den finns, ingår oftast i ORF3 och kodar för ett protein som krävs för virusets rörelse från cell till cell. Luteo- och polerovirus innehåller en ORF3a för vilken översättningen inleds vid ett icke-AUG-kodon. De icke-kodande 3′-regionerna hos lutovirus innehåller translationsförstärkande element (BTE). I PLRV är ORF7 inframe med ORF5:s C-terminus och översättningen av ORF8 förmedlas av en IRES-plats (internal initiation ribosome entry site). Luteo- och polerovirus producerar tre subgenomiska RNA (sgRNA), men enamovirus producerar ett enda sgRNA.
Luteovirider har relativt korta 5′ och intergeniska icke-kodande sekvenser. Den första ORF:n föregås av 21 nt i CABYV RNA och 142 nt i Soybean dwarf virus (SbDV) RNA. ORF 2 och 3 separeras av 112-200 nt icke-kodande RNA. Det finns en betydande variation i längden på sekvensen nedströms ORF5, som varierar från 167 nt för CYDV-RPV till 650 nt för SbDV.
Luteovirider använder sig av ett brett spektrum av strategier för att uttrycka sina kompakta genomer. ORF 0, 1, 2 och 8 uttrycks direkt från genomiskt RNA. ORF:er nedströms uttrycks från subgenomiska RNA:er (sgRNA:er) som transkriberas från interna initieringsställen av viruskodade RNA-beroende RNA-polymeraser (RdRps) från negativsträngade RNA:er och är 3′ co-terminala med det genomiska RNA:et. Eftersom initieringskodonen för ORF0 hos polero- och enamovirus ligger uppströms från ORF1, initieras översättningen av ORF1 genom ”leaky scanning” där ribosomerna förbigår ORF0:s AUG och fortsätter att skanna det genomiska RNA:t tills de når ORF1:s AUG. Proteinprodukterna från ORF2 uttrycks som en translationell fusion med produkten från ORF1. Vid en låg men betydande frekvens under uttrycket av ORF1 fortsätter translationen till ORF2 genom ett -1 frameshift som producerar ett stort protein som innehåller sekvenser som kodas av både ORF 1 och 2 i en enda polypeptid. Frameshiftet förmedlas av en ”glidande hepta-nukleotidsekvens” (i formen X XXY YYZ) och en nedströms RNA-sekundärstruktur, en så kallad pseudoknot, som får ribosomerna att göra en paus och sedan förskjuta sig ett nt bakåt innan de fortsätter översättningen i den nya läsramen. ORF8, som endast har identifierats i PLRV, ligger helt inom ORF1 i en annan läsram och kodar för ett 5 kDa replikationsassocierat protein. För att uttrycka ORF8 viks sekvenser inom ORF till en struktur som kallas IRES (internal ribosome entry site), som rekryterar ribosomer för att påbörja översättningen cirka 1 600 nt nedströms från 5′-terminus av PLRV RNA.
ORF 3a, 3, 4 och 5 uttrycks genom en läckande skanningsmekanism från 5′-terminus av sgRNA1, som ligger cirka 200 nt uppströms från ORF3 i slutet av ORF2 och sträcker sig till genomets 3′-terminus. Översättningen av ORF3a inleds vid ett icke-AUG-kodon. ORF4 hos de flesta luto- och polerovirus ingår i ORF3. I alla luteovirus uttrycks ORF5 endast som en translationsfusion med ORF3:s produkter genom att man läser igenom UAG-stoppkodonet i slutet av ORF3, vilket ger ett protein med ORF3:s produkt vid sin N-terminus och ORF5:s produkt vid sin C-terminus. Läsningen regleras av lokala och långväga RNA-RNA-interaktioner och i fallet med luteovirus och vissa polerovirus krävs förekomsten av CCXXXX-repetitioner (där X är en valfri bas) nedströms från ORF3-stoppkodonet. Luteo- och polerovirus producerar andra mindre sgRNA som kan uttrycka ORF 6 och 7. Tredje sgRNA, som inte tycks koda för proteiner, produceras i mycket höga nivåer i luteovirus, men endast i låga nivåer i PLRV.
Medan enamo- och polerovirus RNA innehåller 5′ VPgs som interagerar med translationsinitieringsfaktorer, innehåller luteovirus RNA endast en 5′ fosfat. Omodifierade 5′-terminaler känns dåligt igen för översättningsinitiering. För att kringgå detta problem innehåller BYDV-PAV-genomet en kort sekvens (BYDV translation element; BTE) belägen i den 3′ icke-kodande regionen nedströms ORF5 som interagerar med sekvenser nära 5′-terminerna av genomiskt RNA och sgRNA1 för att främja cap-oberoende translationsinitiering.
Posttranskriptionell tystnad av gener (PTGS) är ett medfött och mycket adaptivt antiviralt försvar som finns i alla eukaryoter och som aktiveras av dubbelsträngade RNA (dsRNA), som produceras under virusreplikation. Forskning om funktionerna hos de proteiner som kodas av luteovirus har visat att de 28-34 kDa-proteiner som kodas av ORF0 är starka undertryckare av lokal och systemisk PTGS för polero- och enamovirus. Luteovirusgenom saknar ORF0, men produkten av ORF4 i luteovirus fungerar för att undertrycka systemisk PTGS.
De ORF1-kodade proteinerna hos enamo- och polerovirus innehåller VPg och ett chymotrypsinliknande serinproteas som är ansvarigt för den proteolytiska bearbetningen av ORF1-kodade polyproteiner. Proteaset klyver ORF1-proteinet internt för att frigöra VPg, som är kovalent fäst vid genomiskt RNA. Det protein som uttrycks av ORF8 i PLRV krävs för virusreplikation. Luteovirus ORF2 har en kodningskapacitet på 59-67 kDa för proteiner som är mycket lika kända RdRps och därför sannolikt representerar den katalytiska delen av det virala replikaset.
För luteo- och polerovirus producerar ORF3a mycket konserverade proteiner på 4,8-5,3 kDa som är nödvändiga för långväga förflyttning. ORF3 kodar för luteovirusens viktigaste CP, vars storlek varierar mellan 21 och 23 kDa. ORF5 har en kodningskapacitet på 29-56 kDa. ORF5 uttrycks dock endast som en translationsfusion med produkten av ORF3 när, cirka 10 % av tiden, translationen inte stannar vid slutet av ORF3 utan fortsätter fram till slutet av ORF5. ORF5-delen av detta genomgångsprotein har involverats i överföring av bladlöss och virusstabilitet. Försök med PLRV och BYDV-PAV har visat att den N-terminala delen av ORF5-läsningsproteinet bestämmer viruspartiklarnas förmåga att binda till proteiner som produceras av endosymbiotiska bakterier i bladlusvektorer. Viruspartiklarnas interaktion med dessa proteiner verkar vara nödvändig för att virusen ska kunna fortleva i bladlöss. Nukleotidsekvensförändringar inom ORF5 av PEMV-1 upphäver överförbarheten hos bladlöss. De N-terminala delarna av ORF5-proteinerna är mycket konserverade bland luteovirus medan C-terminalerna är mycket mer varierande.
Luteo- och polerovirusgenomerna har en ORF4 som ingår i ORF3 och kodar för proteiner på 17-21 kDa. Virus som innehåller mutationer i ORF4 kan replikera i isolerade växtprotoplaster, men är bristfälliga eller fördröjda i systemisk rörelse i hela växter. ORF4:s produkt tycks alltså vara nödvändig för att viruset skall kunna förflytta sig inom infekterade växter. Denna hypotes stöds av observationen att enamovirus saknar ORF4. Medan luto- och polerovirus är begränsade till floem och tillhörande vävnader kan enamoviruset PEMV-1 förflytta sig systemiskt genom andra växtvävnader i närvaro av PEMV-2, som under naturliga förhållanden alltid samexisterar med PEMV-1.
Vissa luto- och polerovirusgenom innehåller små ORF:er inom och/eller nedströms från ORF5. I luteovirus har inga proteinprodukter påvisats från dessa ORF:er i infekterade celler. BYDV-PAV-genom som inte uttrycker ORF6 kan fortfarande replikera i protoplaster. Den beräknade storleken på de proteiner som uttrycks av ORF 6 och 7 i PLRV är 7,1 respektive 14 kDa. Baserat på mutationsstudier har det föreslagits att dessa genomregioner kan reglera transkriptionen sent under infektionen.