8.3 Kemiska tester
Visualisering av PHGs komponenter på TLC-plattor är möjlig med hjälp av allmänna reagenser för fenoler; järnklorid, vanillin och saltsyra (ger en rad rosa färger med resorcinol- eller phloroglucinolderivat), eller med hjälp av mer specifika tester med 2,4-dinitrofenylhydrazin (upptäcker aldehyder). Folin-Ciocalteus reagens är också användbart för att upptäcka fenoler med katekol- eller hyrokinonkärnor (blåa fläckar uppträder omedelbart efter att TLC-plattan sprutats) eller för andra fenoler, som uppvisar blå till gråa fläckar när plattan rökas med ammoniakångor. Gibbs-reagens (2 % 2,6-diklorokinonklorimid i kloroform) följt av rökning av plattan med 2M NH4OH ger en mängd olika färger (t.ex. kan man skilja mellan vanillinsyra – rosa färg – och isovanillinsyra – blå färg). Cinnaminsyraderivat ger en karakteristisk ljusblå fluorescens när de undersöks i UV-strålning (366 nm). Cis- och transisomerer av cinnamsyror presenteras på TLC-plattor när extraktet kromatograferas i vattenhaltiga lösningsmedel i två riktningar (2D-TLC). Spektrofotometriska metoder för uppskattning av fenolinnehållet används ofta, t.ex. metod med Arnows reagens eller den tidigare nämnda Folin-Ciocalteus reagens .
Vissa kvalitativa tester visar på kumariner i växtextrakt, t.ex, Laktonringstest (kumariner som hydrolyseras av utspädd alkali bildar en gul lösning av O-kumarsyresalter, som kan vändas efter försurning eller mättnad med CO2) eller Azo-kopplingstest (röd färg utvecklas på grund av reaktionen med diazotisering sulfanilsyra i en alkalisk lösning). Kumariner är lätta att upptäcka i UV-ljus (365 nm), eftersom de ger en karakteristisk färgfluorescens (med undantag för enkla osubstituerade kumariner som inte har någon fluorescens). De upptäcks genom sin blå, violetta, bruna, gröna eller gula färg. En 10-procentig lösning av KOH i metanol eller en 20-procentig lösning av antimonklorid i kloroform kan intensifiera färgen. Hydroxykumariner uppvisar inte bathochroma spektralförskjutningar i alkalisk lösning . Vid HPLC-analys med diode array-detektion möjliggör olika UV-spektra av kumariner en snabb identifiering av föreningarna.
Kromoner reagerar i alkalilösningar för att ge O-hydroxi-β-diketon utan regenerering av γ-pyronringen och även färgade föreningar med koncentrerad syra och koncentrerad alkali. Kromoner är också synliga i UV-ljus (blå, gul, gröngul, brun fluorescens vid 365 nm).
Närvaron av den aktiva fenylringen (kromoforen) i flavonoider gör dem lätta att upptäcka i UV-ljus. Deras UV-spektra är särskilt informativa och ger strukturell information som kan särskilja fenoltypen och oxidationsmönstret. Olika kemiska reaktioner genom besprutning av TLC-kromatogram är möjliga; t.ex. visualisering i närvaro av ammoniakånga (chalkoner och auroner blir orange respektive röda) eller besprutning med Naturstoff Reagenz A (1 % lösning av estern av 2-aminoetanol och difenylborsyra) och överbesprutning med 5 % metanolisk lösning av polyetylenglykol 4000 (PEG 4000), vilket ökar känsligheten för denna reaktion. Efter derivatisering kunde föreningarna observeras i UV-ljus (fluorescens från ljusgult till grönt). Andra tester omfattar besprutning med järnklorid, diazoterad sulfanilsyra (båda är reaktioner för fenoler) och den specifika reaktionen cyanidin med magnesiumpulver i närvaro av saltsyra (indikerar förekomst av flavanoner och dihydroflavanoler). För kvantitativ kolorimetrisk uppskattning av flavonoider används reaktion med aluminiumklorid (AlCl3) (absorbansen mäts vid 425 nm). Flavonoider lösta i alkalilösningar ger en intensiv gul färg, som minskar efter tillsats av syra. UV-spektra av flavonoidföreningar visar två huvudband (absorptionsmaxima): band I vid högre våglängd (tillskrivs cinnamoyldelen av flavonoidstrukturen) och band II vid lägre våglängd (tillskrivs benzoyldelen). Band I ligger normalt vid 304-350 nm för flavoner (H vid C-3 i C-ringen), vid 352-385 nm för flavonoler (OH-grupp vid C-3) och vid 328-357 nm för 3-substituerade flavonoler (O-substitution vid C-3). Band II för de flesta strukturer ligger vid ca 250-280 nm. En ytterligare fenolgrupp (-OH) i ring A orsakar den bathochroma förskjutningen (förskjutning till längre våglängder) i band II, och en ytterligare -OH-grupp i ring B genererar en liknande effekt i band I .
De flesta antrakinoner eller deras glykosider bildar gula eller orangeröda kristaller och kan uppvisa fluorescens beroende på pH-värdet . Den viktigaste färgreaktionen är Bornträger-testet, som utförs genom att kinonet löses upp i alkaliskt vattenhaltigt medium. Färgreaktionen sträcker sig från orangerött till purpurviolett (beroende på kinonets struktur och substituenter). Antrakinoner ger en röd färg vid denna reaktion. För 1,8-dihydrokinoner används också reaktion med magnesiumacetat. Antrakinoner kan påvisas på TLC-plattor efter besprutning med 10 % metanolisk KOH-lösning. De ursprungliga gula eller gulbruna färgerna ändras till rött, violett, grönt eller lila. Pulveriserad rabarber kan undersökas i UV-ljus för att upptäcka förekomst av raponthicin (stilbenoidglykosid, som är giftig). I ursprunglig rabarber (Rheum palmatum) uppträder en rödbrun fluorescens, men inga lysande blåvioletta fläckar ses (som i orsak av rhapontisk rabarber-Rheum rhaponticum).
Som tidigare nämnts är saponiner ytaktiva föreningar (ändrar ytspänningen) och har emulgerande egenskaper. För en snabb kvalitativ kontroll av om en växt har SPGs används vanligen ett skumtest genom att skaka växtmaterial med vatten. Saponiner har membranpermeabiliserande egenskaper. Låga koncentrationer av saponiner kan förstöra erytrocytmembranen (vilket kan fällas ut kolesterolet som finns i de röda blodkropparnas membran), vilket orsakar hemolys av blod in vitro. Denna förmåga har lett till en utbredd användning av hemolys (hemolytiskt index-IH) som en metod för att fastställa biologisk aktivitet. IH definieras som den mängd 2 % isotonisk suspension av nötblod (i ml) som genomgår hemolys när den behandlas med 1 g testat växtmaterial (eller testat extrakt). Som referens användes Gypsophila paniculata saponinblandning (IH=30 000) eller Saponin Album (Merck) (IH=15 000). Enligt Hostettmann och Marston varierar den hemolytiska aktiviteten hos saponosider avsevärt med glykosiddelens struktur. Monodesmosidiska saponiner (utom acylglykosider och glycyrrhizin) är starkt hemolytiska. Ingen färgreaktion är särskilt specifik för SPG:er. Liebermanreaktion (med ättiksyraanhydrid i närvaro av svavelsyra) finns dock tillgänglig, där färgerna skiljer sig åt beroende på aglykonens typ (triterpen – rosa till rött – eller steroid – blågrönt) .
Kemiska reaktioner för att identifiera CRG:er i växtmaterial kan bero på aglykonerna eller på sockerarterna. Liebermanns och Salkoviskis test indikerar steroiddelar och är därför inte specifikt för CRGs. Keller Kilianis test och Xanthidrole-test indikerar båda desoxisocker (digitoxos eller cymaros). Kedde- eller Baljet-reaktionen är mer specifik, eftersom den är kopplad till förekomsten av α,β-omättad laktonring. Fluorescerande reaktion av CRGs är också möjlig, t.ex. eliminerar digoxinhydroxylgruppen vid C-14 och C-16 vatten med H2SO4 med bildning av två ytterligare dubbelbindningar. Detta resulterar i ett konjugerat system (med en dubbelbindning i laktonringen) som gör digoxin fluorescerande i UV-ljus. Jensen-reaktionen (efter besprutning med triklorättiksyra i etanol) används för att visualisera CRGs på TLC-kromatogram .
Direkt mätning av totalt HCN genom syrahydrolys av cyanogena glykosider som finns i livsmedel samt nedbrytning av de intermediära cyanhydrinerna till HCN har fördelarna av att kunna tillämpas på alla typer av prover, även om inte allt potentiellt HCN från cyanogena glykosider sannolikt är tillgängligt in vivo. Visualisering av förekomsten av dessa föreningar i växter är möjlig på filterpapper som impregnerats med reagenser, t.ex. pikrinsyra/natriumkarbonat eller bensidin/kupraacetat. Dessa reagenser kan ge färgreaktioner med HCN som frigörs från krossad växtvävnad. Ett impregnerat papper placeras i ett rör över det krossade växtmaterialet och lämnas i inkubation vid 40 °C i 2 timmar. En färgförändring från gult till rödbrunt indikerar enzymatisk frisättning av HCN. Picratpapper är inte helt specifikt för cyanogen (flyktiga isotiocyanater från Brassica-arter reagerar också på denna reaktion). Därför används också ett annat test där man använder en blandning (1:1) av nyberedda lösningar av 1 % 4,4-tetrametyldiamindifenylamin i kloroform (w/v) och 1 % kopparetylacetoacetat i kloroform (w/v). Färgreaktionen övergår från svagt blågrön till ljusgrön. En annan möjlig metod är destillation av växtvävnad i surt vatten och titrering av det frigjorda HCN med silvernitrat. Kromatografiska metoder som HPLC/MS eller GC/MS av trimetylsilylderivat är effektiva för analys av enskilda cyanogena glykosider eller cyanohydriner och ger kemisk karakterisering samt kvantifiering av föreningarna .
På grund av mångfalden av produkter som bildas i växter från glukosinolater (beroende på aglykonstrukturen) kan uppskattning av isotiocyanater med den spektrofotometriska metoden (där färgprodukterna 1,3-benzodithiol-2-tiones bildas genom kondensation av isotiocyanat med 1,2-benzendithiol) vara otillräcklig för att bestämma glukosinolatinnehållet i växter.