Alai

Laboratoriemedicin har gjort betydande framsteg under de senaste två decennierna. Viralbelastningsanalyser har utvecklats från nested PCR-analyser till transkriptionsmedierad amplifiering till realtids-PCR och fortsätter att utvecklas med metoder som digital PCR. Dessa framsteg har resulterat i känsligare virusbelastningsanalyser med ett bredare dynamiskt intervall, vilket ger läkarna en bättre förståelse för patientens svar på behandling och sjukdomsutveckling.

Ett exempel på förbättrad patienthantering med utvecklingen av molekylär diagnostik har varit hanteringen av hiv-1-patienter. Enligt de nuvarande behandlingsriktlinjerna definieras behandlingsframgång som en koncentration av hiv-1 RNA under 75 kopior/mL.1 Definitionen av behandlingssvikt varierar beroende på globala, nationella och landsspecifika riktlinjer, men definieras vanligen som en koncentration av hiv-1 RNA mellan 50-1000 kopior/mL.1-3

Dessa behandlingsgränsvärden ligger i den nedre delen av det dynamiska intervallet för realtids-PCR-analyserna, där precisionen och reproducerbarheten kan ifrågasättas. Faktorer som kan påverka prestandan av virusbelastningsanalyser är den automatiserade plattformen, kemin för extraktion av nukleinsyror, val och utformning av PCR-primer/sondering, PCR-amplifieringsförhållanden och kalibreringsstrategi för analysen. Här kommer vi att granska olika metoder för utformning och deras potentiella inverkan på testets prestanda och det kliniska resultatet. (Figur 1)

Extraktionsprocess

Man bör noga överväga provtyp och analyter när man väljer extraktionskemi. När det gäller hiv-1 rekommenderar till exempel Department of Health and Human Services (DHHS) att hiv-1 RNA ska användas som en markör för hiv-1 viremi.1

Det är viktigt att skilja mellan hiv-1 RNA och proviralt DNA eftersom det sistnämnda inte är en markör för aktiv virusreplikation, utan snarare för att viruset släpper ut latenta reservoarer, som redan har integrerats i cellerna. En extraktionskemi som renar både hiv-1 RNA och proviralt DNA skulle inte ge läkaren en korrekt bild av verklig viral replikation. När det gäller detta virus bör därför endast en extraktionskemi som specifikt renar hiv-1 RNA användas för att utesluta proviralt DNA från kvantifiering i efterföljande led.

Alternativt kan användningen av extraktionskemi för total nukleinsyra (TNA) för kvantifiering av hiv-1 potentiellt leda till falskt positiva resultat eller felaktig kvantifiering, vilket skulle ha negativa effekter på patientens behandling. TNA-extraktionskemi kan användas för svårare provtyper, t.ex. urin eller avföring, eller för analyser som måste detektera både RNA/DNA-mål.

Målval

Den extrema virusdiversitet som förekommer bland hiv-, HBV- och HCV-stammar är av största vikt när det gäller att se till att molekylärdiagnostiska tester (MDx) ger rätt resultat, oberoende av vilken eller vilka stammar som finns i ett prov.

För att lösa detta problem bör den optimala testutformningen börja med valet av primer/sondmål i en genetiskt konservativ region där den virala mångfalden kommer att ha minst potentiell inverkan. De genetiskt konservativa regionerna kan endast bestämmas genom att jämföra sekvenser från olika virusstammar.

För att tillgodose detta behov är ett globalt övervakningsprogram avgörande för att göra en omfattande bedömning av den befintliga virala mångfalden i cirkulationen av hiv-, HBV- och HCV-stammar.4 I ett övervakningsprogram används sekvenser som genererats från stammar som samlats in i geografiskt skilda regioner för att fastställa vilka regioner av ett viralt genom som är mest välbevarade och som är lättast att detektera med ett molekylärdiagnostiskt test. Genom att använda cirkulerande virala sekvenser som underlag för utformning av tester minskas risken för att stammar missas av ett test avsevärt.

Sondutformning och PCR-cykelförhållanden

Förutom valet av målregion är sondutformning och PCR-cykelförhållanden kritiska när vi försöker säkerställa en korrekt kvantifiering av virusbelastningen. Provdesignen måste vara tolerant mot naturligt förekommande polymorfismer och i sin tur potentiella felmatchningar som kan förekomma inom den givna målregionen. Med tiden har sondtekniken utvecklats, liksom PCR-metodiken. Det bredare utbudet av MDx-tillämpningar som bygger på PCR-teknik utöver viral kvantifiering kräver användning av olika sondkonstruktioner. Prober som binder till minor groove används vanligen för genotypning och upptäckt av polymorfism av enstaka nukleotider.

TaqMan-prober används ofta i analyser där målregionerna har en hög grad av bevarande. Delvis dubbelsträngade prober, som är bättre på att tolerera höga nivåer av genetisk heterogenitet främst på grund av sondens längd och bindningsförhållanden, används i områden där det finns en hög grad av heterogenitet5.

Förutom sondens utformning är cykelförhållandena ofta föremål för optimering av utformningen, för att uppnå prestandakraven (t.ex. tolerans för potentiella felmatchningar). Fasmatchad cykling är ett tillvägagångssätt som innefattar cykler vid lägre temperatur för att minska den initiala strängheten, vilket följs av cykler vid höga temperaturer för att bevara specificiteten. Detta tillvägagångssätt mildrar den negativa effekten på provets kvantifiering av potentiella primermissmatchningar. Om det är svårt att undvika den betydande effekten av sällsynta polymorfismer kan detektion av ett andra mål ingå i testutformningen. När sekvensdiversitet påverkar upptäckten av en region av virusgenomet, säkerställer upptäckten av en andra region att ett korrekt resultat uppnås. Med tanke på de molekylära testernas komplexitet och den höga graden av viral mångfald bör man vid utformningen av molekylära tester överväga ett övergripande tillvägagångssätt där man utnyttjar global övervakning och målspecifik sonddesign. Att bara anpassa en strategi, t.ex. en strategi med dubbla mål, kan ge en falsk känsla av säkerhet.

Kalibreringsstrategi

Kalibreringsstrategin är en integrerad del av utformningen av molekylära tester och är avgörande för att säkerställa reproducerbarhet över ett brett dynamiskt område. De flesta kvantitativa metoder för terapihantering använder för närvarande en extern kalibreringskurva för att bestämma koncentrationen av en analyt.

I dessa tester jämförs analytsignalen i ett patientprov med en uppsättning prover med en känd koncentration och en enkel linjär regression (y=mx+b) används för att beräkna virusbelastningen. Detta tillvägagångssätt använder vanligtvis kalibratorer som bearbetas som patientprover genom hela processen, vilket möjliggör kalibrering av både extraktions- och amplifieringsreagenser och instrument.

Alternativt kan kalibratorer som inte bearbetas genom extraktionen användas, men detta tillvägagångssätt medför dock en risk för att skillnader i återvinning eller en förändring i reagensets sammansättning inte skulle beaktas, vilket potentiellt kan leda till skillnader i kvantifiering.

En annan mindre ofta använd strategi är en intern kvantitativ standard. I denna tillämpning används en polynomial regressionslinje av tredje ordningen (y = ax3 + bx2 + cx + d) över det linjära området med en tillåten maximal skillnad från linjäriteten. Tidigare studier har föreslagit att den acceptabla tillåtna skillnaden från linjäritet för vissa analyser var ± 0,2 Log10.6 Denna tillåtna skillnad från linjäritet och kalibreringsmetoden förklarar också den bias som ofta observeras mellan metoderna, liksom den större oprecisionen i den nedre delen av det dynamiska intervallet, där kliniska beslut ofta fattas.

Slutsats

En korrekt och exakt prestanda för molekylära analyser är avgörande för en lämplig terapihantering. Felaktiga resultat för virusbelastning kan leda till olämplig hantering och patienten kan lämnas på misslyckad terapi. Denna felaktiga diagnos har mycket större konsekvenser än hanteringen av en enskild patient, eftersom den också kan leda till en ökad överföring av den resistenta virusstammen. Ur ett terapihanteringsperspektiv är ett virus med mutationer som är förknippade med resistens mer utmanande att behandla med snävare behandlingsalternativ. Dessutom kan falskt positiva resultat leda till onödiga kostnader för upprepade tester eller dyrare resistenstestning samt till oro för patienten och läkaren.

1. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV utarbetat av Department of Health and Human Services. https://aidsinfo.nih.gov/guidelines). Tillgänglig i september 2019.
2. European AIDS Clinical Society (EACS). EACS Guidelines Version 9.1 October 2018.
3. National Department of Health, South Africa, april 2015, åtkomst den 2 augusti 2017: https://aidsfree.usaid.gov/sites/default/files/tx_south-africa_pmtct_2015.pdf.
4. Brennan CA, Bodelle P, Coffey R, et al. Global övervakning av hiv: grund för retroviral upptäckt och utveckling av tester. Journal of medical virology. 2006;78 Suppl 1:S24-29.
5. Luk KC, Devare SG, Hackett JR, Jr. Delvis dubbelsträngade linjära DNA-sonder: ny design för känslig detektion av genetiskt polymorfa mål. Journal of Virological Methods. 2007;144(1-2):1-11.
6. Vermehren J, Colucci G, Gohl P, et al. Utveckling av en andra version av det kvantitativa Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan-testet för hepatit C-virus med förbättrad genotypinkludering. Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(9):3309-3315.

Acknowledgment: Författaren vill tacka Mary Rodgers och Shihai Huang för deras granskning av denna artikel.