Alai

Framställning av temperaturintervallet

De vanligaste laboratorieförhållandena för Macrostomum lignano kulturer är följande: temperatur 20 °C, luftfuktighet 60 % och ljus/mörkercykel 14 timmar/10 timmar. Dessa förhållanden valdes främst för att de är optimala för tillväxten av kiselalgen Nitzschia curvilineata, som är den huvudsakliga födokällan för maskarna . För att bedöma vilka temperaturförhållanden som kan användas i försöket fastställde vi först det temperaturområde där maskarna överlever. Frysning av maskarna visade sig vara dödligt, men de kunde överleva om de förvarades vid 4 °C i minst två veckor. Eftersom kiselalgerna inte växer under dessa förhållanden beslutade vi dock att utesluta 4 °C från vidare experiment. Andra temperaturer under 20 °C uteslöts också från försöket, eftersom det primära målet med studien var att hitta förhållanden som påskyndar tillväxt och utveckling. På andra sidan av temperaturspektrumet löses maskarna upp när de förvaras vid 42 °C i två timmar, och de dog efter en veckas odling vid 37 °C. Därför har vi beslutat att använda 20 °C, 25 °C, 30 °C och 35 °C som våra experimentella förhållanden för att studera långsiktiga temperatureffekter på M. lignano (fig. 1).

Värmeschockreaktion

För att undersöka vilka temperaturer som inducerar stressreaktion hos maskarna övervakade vi aktiviteten hos värmeschock 20-promotorn (Mlig-hsp20). Först utförde vi en kvantitativ RT-PCR för att mäta uttrycksnivån av Mlig-hsp20 vid 20 °C, 25 °C, 30 °C, 33 °C, 34 °C och 35 °C. Det fanns ingen signifikant skillnad i uttrycksnivån för Hsp20 mellan 20 °C och 25 °C (fig. 2a). En liten (2 gånger) men signifikant (P = 0,027, t-test) ökning av uttrycket observerades dock vid 30 °C jämfört med 20 °C (fig. 2a). En mer än tiofaldig ökning av uttrycksnivån observerades vid 33 °C, vilket ökade till mer än 100 gånger vid den högsta testade temperaturen 35 °C (fig. 2a). I det andra testet skapade vi en transgen linje som uttryckte mScarlet-I-protein under kontroll av Mlig-hsp20-promotorn (fig. 2b) och mätte fluorescensnivån 24 timmar efter en två timmar lång inkubation vid olika temperaturer från 20 °C till 37 °C (fig. 2c, d). Mer än två- och tiofaldig ökning av fluorescensen observerades vid 34 °C respektive 37 °C (fig. 2c).

Snabba embryoutveckling

Enligt Morris et al. tar det cirka 120 h (fem dagar) för Macrostomums ägg att utvecklas fullt ut när äggen förvaras vid 20 °C. För att undersöka hur temperaturen påverkar hastigheten på embryoutvecklingen och kläckningen plockade vi nylagda embryon och följde deras utveckling fram till kläckningen vid olika temperaturer. För att undersöka eventuella skillnader på grund av genetisk bakgrund använde vi två M. lignano-linjer som för närvarande används i flertalet studier om M. lignano, nämligen linjerna DV1 och NL10. Dessa linjer härstammar oberoende av varandra från vildtypspopulationer från samma geografiska plats och skiljer sig åt genom en duplikation av en hel kromosom, men beter sig i övrigt mycket likartat under laboratorieförhållanden . Vi studerade först effekten av låg temperatur. Vid 4 °C avbryts äggens utveckling och de kan lagras i minst en månad och återupptar sin utveckling när de återförs till högre temperaturer. Därefter studerade vi hur snabbt äggen utvecklas vid temperaturer mellan 20 °C och 35 °C. Som framgår av figur 3 började äggen kläckas efter sex dagar när de förvarades under standardförhållanden (20 °C). En höjning av temperaturen resulterade i en proportionellt sett snabbare embryonal utveckling och tidigare kläckning, som var två gånger snabbare vid 35 °C jämfört med 20 °C och tog endast tre dagar. Noterbart är att cirka 10 % av äggen förblir okläckta efter åtta dagars inkubation vid 20 °C, jämfört med mindre än 5 % vid högre temperaturer, vilket tyder på att även den högsta testade temperaturen 35 °C inte har några skadliga effekter på embryonens överlevnad.

Reproduktion

Reproduktionshastigheten är en mycket viktig faktor för en modellorganism, eftersom djur med kortare generationstid möjliggör snabbare generering av data i genetiska experiment. Om djuren producerar ett stort antal avkommor kommer dessutom de genererade data i de flesta fall att ha högre statistisk styrka.

För att bedöma temperaturens inverkan på M. lignanos reproduktionshastighet har vi jämfört antalet avkommor som genererades under fem veckor av maskar som hölls vid olika temperaturförhållanden. Försöket inleddes med kläcklingar för att införliva den postembryonala utvecklingen i studien, och både DV1- och NL10-linjen användes. Det tog tre veckor för kläcklingar från båda linjerna att växa och producera den första avkomman vid 20 °C, medan kläckningar vid 25 °C observerades inom två veckor för NL10-linjen men inte för DV1. Vid 30 °C och 35 °C producerade båda linjerna avkomma redan efter två veckor (figur 4). Från och med tre veckor ökade antalet kläckta ungar per vecka från under 200 vid 20 °C till mer än 300 vid temperaturer över 20 °C. Antalet kläckta ungar var högst för maskar som hölls vid 30 °C. Detta gällde för båda de genetiska bakgrunderna, och vi observerade inga signifikanta skillnader mellan DV1- och NL10-linjerna (fig. 4).

Och även om temperaturer på 30 °C och högre resulterade i fler kläckningar aktiverar det också en värmeschockreaktion (fig. 2). För att undersöka den långsiktiga effekten av den förhöjda temperaturen och de potentiella påfrestningar som den kan ha på maskarna, behöll vi maskarna vid de valda temperaturerna och övervakade morfologiska avvikelser efter tre och sex månaders odling. Maskarna som hölls vid 25 °C uppvisade inga morfologiska förändringar vid båda kontrollpunkterna jämfört med maskarna som hölls vid 20 °C (fig. 5). Både vid 30 °C och 35 °C observerades dock olika avvikelser i den allmänna morfologin. Efter tre månader var ett ökat antal cystor, skadad vävnad och förstorade testiklar vanligt förekommande i både DV1- och NL10-linjerna (fig. 5). Ingen av de maskar som hölls vid 35 °C överlevde fram till kontrollpunkten efter sex månader, och alla maskar som överlevde vid 30 °C uppvisade morfologiska avvikelser (fig. 5). Därför är långvarig exponering för temperaturer över 30 °C skadlig för M. lignano.

Regenerationstid

Då den största attraktionen för M. lignano som modellorganism är dess regenerationsförmåga, studerade vi härnäst hur temperaturen påverkar regenerationen. Det är allmänt accepterat att högre temperatur leder till en ökning av den totala metaboliska aktiviteten . För att utvärdera temperaturens påverkan på den tid det tar för en mask att helt regenerera sin kropp efter amputation ovanför testikelregionen, följde vi regenereringen av testiklarna och uppkomsten av spermier i vesicular seminalis med hjälp av en tidigare etablerad transgen linje NL22, som uttrycker GFP under kontroll av den testikel- och spermiespecifika ELAV-promotorn . Användningen av en sådan transgen markör ger bättre precision, konsistens och effektivitet när det gäller att mäta regenerationens omfattning. Faktum är att vi inte observerade någon signifikant variation när vi bedömde tidpunkten för uppkomsten av GFP-signalen efter amputation vid alla testade temperaturer (tabell 1).

Som väntat ökade regenerationshastigheten med temperaturen (tabell 1). Om vi tar regenerationstiden vid 20 °C som standardhastighet är de beräknade temperaturkoefficienterna för regenerering av testiklar Q10 = 4 vid 25 °C och Q10 = 3 för 30 °C och 35 °C. Detta visar att den största effekten uppnås när temperaturen höjs till 25 °C, och att den snabbaste regenereringen sker vid 30 °C, utan att den ökade temperaturen har någon ytterligare effekt på regenereringstiden. Därför bör temperaturer på 25 °C och 30 °C övervägas vid regenerationsexperiment på M. lignano, eftersom det förkortar experimentets längd med två till tre gånger (tabell 1).

RNA-interferens

Knockdown av genuttryck genom RNA-interferens (RNAi) är för närvarande det primära tillvägagångssättet för studier av funktionsbortfall hos M. lignano . I detta tillvägagångssätt blötläggs djuren med dubbelsträngat RNA mot målgenen, och ofta krävs långvariga behandlingar i flera veckor för att observera en fenotyp . Vi har testat hur temperaturen påverkar hastigheten på fenotyputvecklingen vid RNAi-behandling. För att göra detta slog vi ner Mlig-ddx39, en gen som är känd för sin funktion i cellproliferation hos M. lignano och en robust dödlig knockdownfenotyp . I likhet med reproduktionstestet använde vi linjerna DV1 och NL10 för detta experiment (tabell 2). Vid 20 °C tog det cirka 20 dagar för alla djur att dö efter knockdown av Mlig-ddx39. När maskarna hölls vid högre temperaturer inträffade döden snabbare: efter 11 och 8 dagar för maskar som hölls vid 25 °C respektive 30 °C. Det fanns ingen synlig skillnad mellan de två stammar som användes för försöket (tabell 2). Därefter undersökte vi om den observerade ökningen av hastigheten på manifestationen av ddx39 RNAi-fenotypen vid högre temperaturer kan tillskrivas en högre effektivitet i nedsläckningen av gener med RNAi, eller om den beror på andra faktorer. För detta mätte vi med qRT-PCR abundansen av Mlig-ddx39-transkript vid olika tidpunkter efter starten av RNAi-experimentet vid olika temperaturer (fig. 6). Djur som behandlats med dsRNA mot gfp användes som referenskontroller. Vid alla testade temperaturer observerades inga signifikanta variationer i uttrycksnivåerna av Mlig-dddx39 mellan kontrollproverna under experimentets gång (fig. 6). Samtidigt observerades för de Mlig-dddx39 dsRNA-behandlade djuren en nedgång på ~ 80 % i nivån av ddx39-transkriptioner redan efter en dags behandling vid 20 °C eller 25 °C, och till och med en högre nedgång på ~ 90 % vid 30 °C. Efterföljande dagar stabiliserades dock knockdown-nivåerna på cirka 95 % vid alla temperaturer. Vi drar därför slutsatsen att kinetiken för RNAi i sig inte påverkas nämnvärt av temperaturen. Istället kan den observerade förkortningen av tiden för manifestationen av Mlig-ddx39 RNAi-fenotypen vid högre temperaturer förklaras av den ökade cellomsättningshastigheten.

För att testa om den accelererande utvecklingen av RNAi-fenotyper vid förhöjda temperaturer kan generaliseras till andra gener undersökte vi Mlig-sperm1-genen, vars knockdown leder till onormal spermamorfologi och förstorade testiklar . Detta är en långsam RNAi-fenotyp som tar 2-3 veckor att utveckla vid 20 °C . För att kvantifiera omfattningen av fenotypen vid olika temperaturer räknade vi på dag 4 av RNAi-behandlingen andelen djur med testiklar som var förstorade till den grad att de rörde vid varandra. (Fig. 7). I likhet med resultaten med Mlig-ddx39 RNAi resulterade högre temperaturer i en snabbare utveckling av fenotypen, och medan inga tillräckligt förstorade testiklar observerades efter fyra dagars dsRNA-behandling vid 20 °C, hade 25 och 85 % av djuren utvecklat förstorade testiklar vid 25 °C respektive 30 °C (tabell 2). I likhet med regenerering kan alltså RNAi-fenotyper påskyndas med temperaturen hos M. lignano och högre temperaturer kan användas för att förkorta experimentens längd.