Alai

Abstract

Rheumatoid artrit (RA) är en autoimmun sjukdom. Getinggift (WV), som betraktas som en traditionell folkmedicin i Jingpo nationalitet i Yunnan, Kina, lindrar reumatoid artrit. Den aktuella studien syftade till att undersöka effekten av getinggift som förbättrar symtom på reumatoid artrit hos försöksråttor. Vi etablerade en modell för typ II kollagen- (CII-) inducerad artrit (CIA) hos SD-råttor och undersökte inhiberingen av inflammation och autoimmun respons. WV:s antiartritiska effekter utvärderades genom svullnad i tassarna, och histopatologisk poäng och histopatologiska förändringar av den drabbade tassens utseende bedömdes. De antiinflammatoriska effekterna bedömdes genom nivån av IL-6, TNF-α, IL-1β och antalet inflammatoriska celler i perifert blod. Förändringen av förhållandet mellan T-cellsubgrupper i råttornas mjälte upptäcktes med flödescytometri, och samtidigt utvärderades visceraindex och immunserumglobulinnivåer. Resultaten tydde på att olika doser av WV (0,125, 0,25 och 0,5 mg/kg) signifikant lindrade svullnad i tassarna och artritpoäng hos CIA-råttor jämfört med den obehandlade kontrollen (). WV (0,25 och 0,5 mg/kg) lindrade synovialvävnadslesioner i ankellederna och histopatologiska poäng av synoviocythyperplasi och inflammatorisk cellinfiltration med fordonsgruppen (). När det gäller immunologisk reglering sänkte 0,5 mg/kg WV immunserumglobulinnivåerna (), och vi fann vidare att WV (0,5 mg/kg) undertryckte Th-cellernas immunsvar, samtidigt som det förbättrade funktionerna hos Tc-celler och Treg-celler i mjältceller markant (). Den immunsuppressiva verkan av WV som visades var analog med dess hämmande effekt på IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-6, COX-2 och PGE2-nivåerna i råttserum. Sammanfattningsvis visade dessa resultat att WV uppvisade antiartritisk aktivitet, vilket kan vara förknippat med deras hämmande effekter på immunoregulering och antiinflammatorisk verkan.

1. Introduktion

Rheumatoid artrit (RA) är en kronisk autoimmun sjukdom som kan utvecklas till systemiska komplikationer, fysiska handikapp och till och med tidig död . Hyperplasi av synovialcellerna, kronisk inflammation i synoviala celler och förstörelse av brosk och ben är de viktigaste kännetecknen för RA. Dessutom spelar de synergistiska effekterna av T-celler, B-celler och proinflammatoriska cytokiner också en nyckelroll i den patofysiologiska processen . När CD4+ T-celler aktiveras producerar de proinflammatoriska cytokiner som förstärker immunsvaret genom att stimulera andra mononukleära celler, synovialfibroblaster, kondrocyter och osteoklaster. Frisättningen av dessa proinflammatoriska cytokiner, särskilt TNF-α, IL-6 och IL-1β, kan bidra till synovit .

För närvarande fokuserar de kliniska behandlingsläkemedel som används för att behandla RA i första hand på att reducera inflammatoriska mediatorer, t.ex. icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID), sjukdomsmodifierande antirheumatiska läkemedel (DMARD) och biologiska medel. Exempelvis godkändes folatanalogen metotrexat (MTX), som en NSAID, av FDA för RA 1988. Dessutom har det blivit det mest använda vid behandling av RA på grund av sin immunosuppressiva aktivitet, antiinflammatoriska effekt och låga kostnad . MTX är dock inte ett idealiskt terapeutiskt medel på grund av dess oönskade biverkningar på det neuronala, gastrointestinala och immunförsvaret, och det gäller även andra läkemedel . Därför söker allt fler människor efter nya alternativ för att komma till rätta med dessa läkemedels ineffektivitet och säkerhet. I traditionell kinesisk medicin (TCM) anses RA vara ett arthralgisyndrom (”Bi Zheng” i TCM), eventuellt orsakat av exogena vindar, fukt och värme- eller köldpatogener . Tillämpningen av TCM i förebyggande och behandling av sjukdomar har en historia som sträcker sig över flera århundraden, och den ökande betydelsen för RA-behandling tillskrivs dess anmärkningsvärda effektivitet men färre biverkningar och kostnader .

Venomterapi, som ett komplementärt och alternativt medicinskt tillvägagångssätt, har använts i flera århundraden för att behandla smärta, inflammation och artrit inom folkmedicinen . Så tidigt som under krigstiden finns det i den gula kejsarens inre kanon (”Huangdi Neijing” på kinesiska) en notering om att ”bistick är terapeutiskt trots den giftiga risk som uppstår”. Enligt modern medicinsk forskning har biogift (BV) antiartritiska, antiinflammatoriska och smärtstillande effekter som kan tillskrivas aktiveringen av det centrala hämmande systemet och moduleringen av immunsystemet genom flera olika mekanismer . Flera kliniska prövningar har också visat att BV kan förbättra artritrelaterade symtom .

Biogift innehåller en mängd olika biologiskt aktiva beståndsdelar, bland annat biogena aminer, ämnen med hög molekylär massa (t.ex. enzymer, allergener och bioaktiva peptider) och polyamintoxiner. Getinggift uppvisade olika farmakologiska effekter vid behandling av smärta, inflammatoriska sjukdomar och neurodegenerativa sjukdomar . Vespa magnifica (Smith) är en sorts social geting som finns i Yunnan, Kina . På senare år har många föreningar med antikoagulerande, trombocythämmande, antiinflammatoriska och immunosuppressiva egenskaper avskilts från deras gift . På grund av dess anmärkningsvärda effekt på reumatoid artrit har det blivit en vana att användas i stor utsträckning i Jingpo, en kinesisk nationell minoritet . Ändå har det, så vitt vi vet, bara funnits några få rapporter om antirheumatiska verkningar av getinggift.

I det aktuella arbetet antogs den kollageninducerade artritmodellen (CIA) för att nära replikera patogenesen för RA. Förändringar i tassvolym har klassiskt använts för att utvärdera antiinflammatoriska effekter på RA som vanligt . Dessutom bedömde vi effekten av WV (getinggift från Vespa magnifica) i samma modell. Slutligen observerades WV:s effektivitet på antiinflammatorisk och immunmodulation genom H&E-färgning av ledvävnad, flödescytometri av undergrupper av T-celler i mjälte samt ELISA av serum IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, COX-2, PGE2 och reumatoidfaktorer (IgG, IgA och IgM).

2. Material och metoder

2.1. Försöksdjur

Manliga SD-råttor (60 råttor, 180-220 g) erhölls från Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd. Djuren hölls i standardburar av polypropen som fodrades med råskal (förnyades efter 48 timmar). Djurstallet hölls i en 12 timmars ljus-/mörkercykel vid cirka 22 ± 2 °C och en relativ luftfuktighet på 60-70 %, och djuren hade fri tillgång till vatten och standardfoder. Råttorna tilldelades slumpmässigt 8 kontroller och 52 modeller, och sedan gavs en anpassningsperiod på minst 7 dagar för varje försök. Alla experimentella förfaranden genomfördes i enlighet med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health) och godkändes av den etiska kommittén vid Dali University.

2.2. Djurmodell för CIA och behandlingsprotokoll

Råttor desinficerades med alkohol och injicerades subkutant vid höger vola pedis, rygg och svans med 1 mg/ml CCII (kyckling typ II kollagen) emulgeringsmedel för den första immuniseringen, som består av CCII (C9301, Sigma) emulgerat 1 : 1 med ofullständigt Freunds adjuvans (F5506, Sigma). Induktionsdagen utformades som dag 0. Boosterdosen injicerades på nytt på buken, ryggen och svansen tillsammans med 1 ml CCII-emulgeringsmedel på dag 8. Den injicerade foten definierades som den inflammatoriska foten, medan den andra foten utan injektion noterades som den sekundära foten. Därefter behandlades råttorna med kollageninducerad artrit (CIA) på dag 14 och avslutades på dag 28. Efter att CIA hade börjat uppträda delades modellråttorna slumpmässigt in i fem grupper enligt de kliniska poängen. Grupp I: modellgrupp som fick en hypodermisk injektion (1 ml/kg) av normal koksaltlösning som vehikel. Grupperna II-IV: CIA-råttor som fick en hypodermisk injektion av 0,125, 0,25 och 0,5 mg/kg WV (getinggift från Vespa magnifica (Smith) i Yunnan, Kina, frystorkat pulver tillverkat av exsudat från getingarnas svanskörtlar, utspätt med normal koksaltlösning) som behandlingsgrupper. Grupp V: Positiv kontrollgrupp fick TwHF (Tripterygium wilfordii Hook F, nr 20181001, Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co., Ltd.) på 9 mg/kg på samma sätt. Samtidigt gavs samma volym vanlig koksaltlösning ensam till de normala råttorna i kontrollgruppen. Råttorna ovan fick en daglig administrering i 14 dagar.

2.3. Grundläggande utvärdering av experimentell artrit

Svårighetsgraden av CIA utvärderades regelbundet baserat på svullnad i tassarna och artritpoäng. Råttorna vägdes dag 0-28 i studien, och tjockleken och omkretsen på fotlederna i den inflammatoriska foten (höger fot) och den sekundära foten (vänster fot) mättes separat med hjälp av ett skjutmått och ett måttband på dag 0, 14 och 28. Artritpoängen bedömdes utifrån oberoende observationer av tre forskare. Varje tass poängsattes på en skala från 0-4, vilket innebär att den högsta totala poängen för båda bakfotslederna var 8. Bedömningskriterierna var följande: 0 = inget ödem eller några visuella förändringar; 1 = lätt ödem och begränsad erytem; 2 = lätt ödem och erytem; 3 = uppenbart ödem och betydande erytem; och 4 = allvarligt ödem och omfattande erytem . På dag 28 offrades djuren, och sedan samlades serumet och de sekundära fotlederna in och bearbetades för vidare analys.

2.4. Histopatologi av fotled

De vänstra baklåren utan att gallra bort angränsande vävnader tvättades omedelbart med PBS 2-3 gånger, fixerades med 10 % formalin i 48 timmar och avkalkades med 5 % salpetersyra i 24 timmar tills benkortexen lätt kunde genomköras med en nålspets. Proverna bäddades in i paraffinsnitt och skars i skivor (5 μm) för rutinmässig hematoxylin-eosinfärgning (H&E). Patologiska förändringar i lederna upptäcktes med ett ljusmikroskop (Olympus, Japan) och fotograferades. Bilderna togs i 200x förstoring. Förändringar i synoviocythyperplasi och inflammatorisk cellinfiltration upptäcktes också. Histopatologiska förändringar poängsattes respektive med hjälp av följande kriterier: 0 = inga påvisbara förändringar; 1 = milda; 2 = måttliga; 3 = allvarliga .

2,5. Analys av visceraindex

Råttor offrades och hela levern, mjälten och thymus resecerades med omgivande fettvävnad och fascia noggrant separerade. Den våta massan av lever, mjälte och thymus mättes med hjälp av en elektronisk våg och visceraindex (inklusive leverindex, mjältindex och thymusindex) beräknades enligt följande formel. Viskeraindex = organmassa (mg)/kroppsmassa (g) × 100 %.

2,6. ELISA av biokemiska serumindex

Serumet från försöksråttor samlades in och koncentrationerna av TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2 och PGE2 påvisades med hjälp av ELISA-kit (enzyme-linked immunosorbent assay) (Nanjing JianCheng, Kina) enligt tillverkarens anvisningar. ELISA-kits för att upptäcka uttrycksnivåerna för IgA (ERC015), IgG (ERC016) och IgM (ERC017) köptes från NeoBioscience Co., Ltd., Shenzhen, Kina.

2.7. Flödescytometri av mjälte med artrit

Antalet undergrupper av T-celler påvisades med hjälp av flödescytometri. Lymfocyter skördades från mjältceller från råttor, som homogeniserades genom att passera genom 200 mesh nylonsikt. Cellerna filtrerades i PBS-buffert som innehöll 10 % fetalt bovint serum. Cellkoncentrationen justerades till cirka 2 × 106/ml, och 3 ml lysisbuffert för röda blodkroppar (Solarbio, Kina) tillsattes för att lösa upp röda blodkroppar i mindre än 5 minuter. Därefter centrifugerades cellerna i 1 200 rpm i 5 minuter, tvättades två gånger med FBS-PBS-buffert som innehöll 10 % serum från fetalt nötkreatur och centrifugerades sedan i 1 200 rpm i 5 minuter. Varje 100 μl cellsuspension placerades i centrifugeringsrör. Lymfocyterna följdes genom färgning med anti-CD3-FITC (nr 557354; BD, USA), anti-CD4-APC (nr 565432; BD, USA), anti-CD8-PerCP (nr 558824; BD, USA) och anti-CD25-PE (nr 554866; BD, USA). De monoklonala antikropparna tillsattes till varje rör, blandades på nytt och lämnades på is i 30 minuter. FBS-PBS-buffert (1 ml) tillsattes till varje provrör och centrifugerades vid 1200 rpm i 5 minuter, och supernatanten övergavs. Föregående steg upprepades två gånger så att cellerna utan bindning till monoklonala antikroppar eluerades ut helt och hållet. Experimentcellerna blandades med 500 μL FBS-PBS-buffert. Förhållandet mellan CD25+/CD4+ och CD4+/CD8+ T-celler bestämdes med hjälp av en FACS Canto Flow-cytometer (BD, USA) .

2,8. Statistiska analyser

Data analyserades statistiskt med hjälp av SPSS10.0. Data presenterades som medelvärde ± standardavvikelse för medelvärdet (S.D.M.). Betydelsen av skillnaderna mellan varje grupp analyserades med envägs ANOVA följt av ett Tukey-test. I synnerhet analyserades artritpoängen och den histopatologiska poängen med Wilcoxon rangsummetest. Värden på ansågs vara statistiskt signifikanta.

3. Resultat

3.1. WV lindrade artritsymptomen hos CIA-råttor

Artritsymptomen inducerades framgångsrikt hos råttor genom att injicera kollagen av typ II enligt instruktionerna, vilket förkroppsligades i betydande makroskopiska tecken på allvarlig rodnad och svullnad i den sekundära tass- och fotledsleden hos CIA-råttor i figur1(a), om man jämförde med den friska kontrollgruppen. Fotledens tjocklek och omkrets var uppenbarligen ökad i fordon på dag 14 (figur 1(b)) jämfört med kontrollerna; de var dock påfallande minskade efter TwHF och alla WV-behandlade grupper på dag 28 i jämförelse med modellgruppens tjocklek och omkrets (alla ) (figur 1(b)). När vi mätte fotledens tjocklek och omkrets i både den inflammatoriska foten och den sekundära foten visades den uppenbara svullnadssänkningen utifrån data (figur 1(b)). Resultaten av svullnadsgraden visade att WV kunde kontrollera tassödem och lindra den sekundära inflammationen på tass och fotled motsvarande TwHF-effekten.

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Figur 1

Effekt av WV på artrossymptom i varje grupp. (a) Svullnadsgrad av tassar i alla grupper. (b) Fotledens tjocklek och omkrets både i den inflammatoriska foten och den sekundära foten bland alla grupper. (c) Jämförelse av artritpoäng bland alla grupper.

Fortfarande minskade artritpoängen med varierande grad genom behandling med WV beroende på dosens storlek som visas i figur 1(c). Artritpoängen i fordonsgruppen var 6,5 ± 1,0 på dag 14 (jämfört med dag 0, ). Indexet minskade signifikant i den grupp som behandlades med TwHF dag 28 och visade 2,8 ± 0,8 (jämfört med dag 14, ). På samma sätt var minskningen av index med WV signifikant och dosberoende (3,2 ± 0,6 vid 0,5 mg/kg, 4,3 ± 0,7 vid 0,25 mg/kg och 5,6 ± 0,7 vid 0,125 mg/kg) (severa vs 14 dagar, ). Detta visade att effekten av WV vid 0,5 mg/kg motsvarade den hos gruppen som behandlades med TwHF.

3.2. WV lindrade de patologiska förändringarna i lederna hos CIA-råttor

H&E-färgning (figur 2(a)) visade att synovialmembranet i fotledarna från kontrollråttorna hade ett regelbundet cellarrangemang, utan någon synoviocythyperplasi, inflammatorisk cellinfiltration och en slät broskyta. I jämförelse med detta var den histologiska arkitekturen i lederna hos råttorna i vehikelgruppen tydligt onormal med immuncellsinfiltration, synoviocythyperplasi, ökat antal kärl och erosion av brosk och ben. Lederna i TwHF- och WV-grupperna var signifikant försvagade jämfört med lederna i fordonsgruppen och rörde sig mot lederna i kontrollgruppen. Histopatologiska resultat (figur 2(b)) visade (fordonsgruppen) på onormala synovialfoderceller och infiltration av inflammatoriska celler i artritiska leder. Behandlingarna med TwHF och WV sänkte signifikant det genomsnittliga histopatologiska resultatet och återställde brosket jämfört med fordonsgruppen (se figur 2(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 2

Effekter av WV på artritutveckling och ledhistologi hos CIA-råttor. (a) Histopatologi av ledvävnadssektioner från CIA-råttor som behandlats med olika doser av WV och TwHF och normala råttor genom H&E-färgning. Originalförstoring ×200. a, benförstöring, b, immuncellsinfiltration, c, hypertrofisk synovium. (b) Histopatologiska resultat av synoviocythyperplasi och inflammatorisk cellinfiltration i alla grupper. , jämfört med kontrollgruppen; , jämfört med fordonsgruppen.

3.3. Effekter av WV på leverindex och immunserumglobulinnivåer hos CIA-råttor

Jämfört med kontrollgruppen minskade leverindexet i fordonsgruppen signifikant () och WV (0,25 och 0,5 mg/kg) ökade markant (). Jämfört med kontrollgruppen ökade miltindex och thymusindex i fordonsgruppen markant (); TwHF och WV spelade en hämmande effekt på dem som särskilt avspeglades i effekten av 0,5 mg/kg dos av WV på thymusindex (figur 3(a)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 3

Effekter av WV på visceraindex och immunserumglobulinnivåer hos CIA-råttor. (a) Förändringar i milt-, thymus- och leverindex i alla grupper. (b) Uttrycket IgG-, IgA- och IgM-nivåer i serum i alla grupper. , jämfört med kontrollgruppen; , jämfört med fordonsgruppen.

Expressionen av IgG-, IgA- och IgM-nivåerna förbättrades dramatiskt hos CIA-råttor () jämfört med kontroll, medan de blev lägre efter TwHF-bearbetning (). Och nivåerna av IgG i serum minskade i WV-gruppen (0,5 mg/kg) jämfört med fordonsgruppen (). Denna hämning gällde även IgA och IgM i WV-grupperna (0,25 och 0,5 mg/kg) (figur 3(b)).

3.4. Effekter av WV på T-cellsubsetter i mjälten hos CIA-råttor

Antalet CD4+ T-celler ökade signifikant i vehikelgrupperna jämfört med kontrollgruppen (), medan antalet CD4+ T-celler i TwHF- och WV-grupperna (0,5 mg/kg) var signifikant lägre än i vehikelgruppen (figur 4(a)). Jämfört med kontrollgruppen minskade antalet CD4+CD25+ T-celler i fordonsgruppen signifikant (), medan de ökade signifikant i TwHF- och WV (0,5 mg/kg)-grupperna () men var inte uppenbara i de andra grupperna (figur 4(a)). Jämfört med kontrollgruppen var minskningen i fordonsgruppen av antalet CD8+ T-celler anmärkningsvärd, men endast WV (0,125 och 0,25 mg/kg) fick antalet att öka (, ) i figur 4(b).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 4

Antalet undergrupper av T-celler i mjältceller genom flödescytometri. (a) Resultaten av FCM på antalet Th-celler och Tc-celler (vänster); resultaten av FCM på antalet Treg-celler (höger). (b) Stapeldiagrammet visade den negativa effekten av WV och TwHF på Th-celler och den positiva effekten på Tc-celler och Treg-celler. , jämfört med kontrollgruppen; , jämfört med fordonsgruppen.

3,5. WV reglerade serumcytokiner och mediatorer hos CIA-råttor

ELISA-kits (figur 5) visade att jämfört med kontrollgruppen var serumnivåerna av IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE2, COX-2 och IL-8 signifikant förhöjda i fordonsgruppen och återställdes markant av TwHF (9 mg/kg) och WV (0,5 mg/kg) (). Samtidigt undertrycktes uttrycken av IL-6 och PGE2 av 0,125 och 0,25 mg/kg dosering av WV (). WV (0,125 och 0,25 mg/kg) minskade på liknande sätt uttrycket av COX-2 och IL-8 jämfört med fordonet (, ). Detta tydde på att CCII-inducerad inflammation sannolikt medierade de patologiska förändringar som sågs hos de artritiska råttorna, och WV kunde lindra det inflammatoriska svaret.

Figur 5

Effekter av WV på IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, PGE2 och COX-2 nivåer i CIA-råttors serum. , jämfört med kontrollgruppen; , jämfört med fordonsgruppen.

4. Diskussion

RA är en kronisk autoimmun sjukdom som kännetecknas av smärta, svullnad och gradvis förstörelse av lederna, vilket resulterar i funktionsförlust . cOch även om metotrexat (MTX)-tabletter offen anses vara ett behandlingsläkemedel för reumatoid artrit , är de vanligen förknippade med läkemedelsbiverkningar (ADR) . Därför försökte vi utvärdera om getinggift (WV) skulle kunna utgöra ett potentiellt alternativt läkemedel för RA.

Den aktuella studien var den första, till vår kännedom, att undersöka den terapeutiska rollen av WV (från Vespa magnifica) i kollageninducerad artrit (CIA) inducerad i SD-råttor och jämfördes med den kliniskt bevisade effekten av TwHF. Tripterygium wilfordii Hook F (TwHF), även känd som Lei Gong Teng i TCM, har använts för att behandla RA i många år i Kina, och extrakten från TwHF har visat antiinflammatoriska och immunosuppressiva aktiviteter både i in vivo- och in vitro-studier . Vi etablerade modellen med CIA-råttor i 14 dagar och tog bort 12 uppenbara inkompetenser som kan ha berott på misslyckad injektion från 52 råttor, det vill säga CIA-råttorna hade en artritfrekvens på 77 %. Kontrollgruppen visade inga tecken på vare sig ödem eller inflammation (figur 1 och 5), och våra resultat stämmer överens med tidigare studier av RA och CIA, som rapporterade att CCII-emulgeringsmedel inducerade svårighetsgraden av ödem och inflammatoriska skador i lederna . Därefter liknade de förbättrade symtomen i WV-gruppen (0,5 mg/kg) dem för det positiva läkemedlet TwHF, som har rapporterats hämma det inflammatoriska svaret vid RA , men effekten av den låga dosen var inte signifikant på svullnadsminskning och hämning av IL-1β och TNF-α (figurerna 1 och 5). Dessutom noterade vi att råttorna i fordonsgruppen hade ruggigare päls och sämre mentalt tillstånd än råttorna i kontrollgruppen; dessa förhållanden hade blivit desto bättre i behandlingsgruppen.

För att ytterligare utvärdera den terapeutiska effekten av WV utfördes H&E-färgning i vävnadsprover från vänster bakre fotled för att analysera den patologiska funktionen, och vi fann att synovialceller orsakar inflammation, proliferation och invasion av lokaliserat brosk och ben i fordonsgruppen (figur 2), och dessa makroskopiska förändringar överensstämmer med tidigare rapporter . Dessutom minskade TwHF och WV-behandling i 14 dagar signifikant synovialcellshyperplasi och inflammatorisk cellinfiltration jämfört med obehandlad (figur 2). Kronisk synovit är den patologiska grunden för RA . Synovialinflammationen drivs av ett komplext samspel mellan synoviocyter och infiltrerande celler från det medfödda och adaptiva immunsystemet . Därför beräknades det viscerala indexet för immunorgan som mjälte och thymus i detta experiment. Det är värt att nämna att vi inte fann någon signifikant skillnad i vikt mellan vehikel- och behandlingsgruppen; därför använde vi det representativa viscera-indexet för att återspegla råttornas allmänna hälsa. Vi fann att TwHF och WV kunde minska ökningen av visceralindexet för mjälte och thymus hos CIA-råttor (figur 3(a)); detta kan återspegla deras roll i att lindra den immunförstärkning som orsakas av RA. Vi noterade också förändringen i leverindex under denna process; våra resultat visade att TwHF inte återupplivade leverindexet även om behandlingen var effektiv, vilket påminde oss om dess toxicitet för levern i tidigare rapport . Lyckligtvis hittades detta inte i WV-gruppen (figur 3(a)). Med undantag för minskat leverindex i fordons- och TwHF-gruppen observerades inga biverkningar hos dessa råttor, vilket kan bero på den låga dos vi använde. Dessutom upptäckte vi också reumatoida faktorer (RF), som är en diagnostisk markör för RA, som huvudsakligen omfattar IgG-, IgA- och IgM-isotyperna; den har en hög detektionsfrekvens hos patienter med RA . Denna studie visade att obehandlade CIA-råttor hade betydligt högre nivåer av IgG-, IgA- och IgM-antikroppar i serum än de i TwHF- och WV-grupperna (figur 3(b)); dessa resultat stämde väl överens med de kliniska data som rapporterats. Således kunde man se att TwHF och WV (0,5 mg/kg) kunde nedreglera det överdrivna autoimmuna svaret hos CIA-råttor till en nivå nära det normala. Däremot var effekten av WV (0,125 och 0,25 mg/kg) inte uppenbar, medan det återstår att se om en högre dos kommer att förbättra effekten snarare än att fungera som ett gift, så vi fokuserade fortfarande på dessa tre doser för att utforska effekten av WV på RA i det här experimentet.

Preventionell forskning har visat att synovialinflammation rekryterar och aktiverar immunceller genom att producera mediatorer, och T-cellerna spelar viktiga roller i regleringen av RA . När det gäller de proinflammatoriska cytokinernas roll i autoimmunitet är det viktigt att ta hänsyn till balansen mellan olika undergrupper av T-celler, som huvudsakligen är uppdelade i två hypotyper enligt deras funktion och fenotyper: CD4+ hjälpar T-celler (Th-celler) och CD8+ cytotoxiska T-celler (Tc-celler). Th-celler och Tc-celler, som kännetecknas av produktion av olika specifika cytokiner, underlättar det adaptiva immunsvaret . Däremot har CD4+CD25+ T-celler (Treg-celler) en central funktion för att upprätthålla immuntolerans genom att kontrollera inflammatoriska reaktioner och undertrycka aktiviteten hos de ovan nämnda immuncellerna . I den här studien fann vi en stor koncentration av Th- och Tc-celler i mjältecellerna och noterade också en försämrad funktion hos Treg-cellerna hos CIA-råttor. Lyckligtvis skyddades balansen mellan undergrupperna av T-celler med TwHF- och WV-behandling (figur 4). Noterbart är att ackumulationen av immunceller främjar lokal ledinflammation, och de aktiverade immuncellerna släpper ut en stor mängd proinflammatoriska cytokiner, som sedan inducerar aktivering och proliferation av synovialceller och ytterligare förvärrar ledinflammationens utveckling . Tidigare studier har visat att IL-6 är den mest dominerande cytokinen i patogenesen av RA , och överdrivna mängder IL-1β, liksom TNF-α och IL-8, har hittats i synovialvätskan hos RA-patienter . Produktionen av COX-2 och PGE2 efter stimulering med IL-1β har också ökat, och genom att blockera dem lindrades symtomen på RA avsevärt . Liknande resultat observerades i våra experimentella resultat, och vi bekräftade att TwHF och WV (0,5 mg/kg) effektivt kunde minska nivåerna av IL-6, IL-8, PGE2 och COX-2. Även de ökade koncentrationerna av IL-1β och TNF-α som inducerades av RA undertrycktes med undantag för WV (0,125 och 0.25 mg/kg) grupper (Figur 5).

Dessa resultat tyder på att WV har funktioner för att lindra ledsvullnad, hämma synovialinflammation, undertrycka överdriven immunsvar och skydda immunhomeostas, vilket kan förbättra symtomen och bli effektiva botemedel mot RA. Det har rapporterats att getinggift innehåller ett antal bioaktiva molekyler, inklusive aminer, små peptider och även enzymer, allergener och toxiner med hög molekylmassa . Det som skiljer WV från BV är att BV främst har antiinflammatoriska, antioxidativa och analgetiska effekter på RA, och det innehåller en mängd olika peptider, inklusive melittin, fosfolipas A2, apamin och så vidare . Mekanismerna för behandling av RA med dessa två gifter kan vara olika och är värda ytterligare studier. Även om inga biverkningar observerades i intervallet 0,125 till 0,5 mg/kg WV krävs ytterligare utvärdering av de aktiva ingredienserna och säkerheten hos WV-extraktet.

5. Slutsatser

Vampgift lindrade synovial hyperplasi och broskdestruktion orsakad av CIA, möjligen på grund av minskningen av den proinflammatoriska faktorn och immunoreguleringseffekten. Denna studie visade att getinggift kunde ha varit ett potentiellt terapeutiskt alternativ för RA. Förutom att WV har varit ett folkrecept i många år förtjänar det ytterligare studier för att upptäckas, utforskas och erkännas.

Data Tillgänglighet

Data som används för att stödja resultaten i denna studie ingår i artikeln och kan göras fritt tillgängliga.

Etiskt godkännande

Studien godkändes av den institutionella kommittén för vård och användning av djur (IACUC) vid Dali University.

Intressekonflikter

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter som rör publiceringen av denna artikel.

Författarnas bidrag

YG skrev manuskriptet och hjälpte till med konstruktionen och grupperingen av djurmodeller. WXY och HL utförde H&E-färgning och flödescytometri. XMD och LLN ansvarade för ELISA-kits. ZBY, HRZ och HX bidrog i hög grad till att skriva manuskriptet. ZBY och CGZ administrerade och övervakade projektet. Alla författare läste och godkände det slutliga manuskriptet.

Acknowledgments

En del av detta arbete stöddes av Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics. Denna studie finansierades av National Natural Science Foundation of China (bidrag nr 81360679 och 81703742), Yunnan Applied Basic Research for Young Scholars (bidrag nr 2016FD074), Natural Science Foundation of Yunnan Province (bidrag nr. 2017FA050) och Dali University Innovation Team of Advanced Pharmaceutics of Entomological Bio-Pharmacy R&D (bidrag nr ZKLX2019101).