Síťovací činidla nebo síťovače se používají ke kovalentní vazbě dvou nebo více proteinových molekul, aby se usnadnila identifikace vztahů mezi blízkými proteiny, interakcí ligand-receptor, trojrozměrných proteinových struktur a molekulárních asociací v buněčných membránách. Stejným způsobem je lze použít také k modifikaci nukleových kyselin, léčiv a pevných povrchů a při přípravě konjugátů protilátek a enzymů a imunotoxinů.
Jak to všechno tato činidla dokážou? Jednoduše. Činidla pro zesíťování bílkovin obvykle obsahují dvě nebo více chemicky reaktivních skupin, které se připojí k funkčním skupinám (např. primárním aminům, sulfhydrilům, karbonylům, sacharidům a karboxylovým kyselinám) nacházejícím se v bílkovinách a jiných molekulách. Díky těmto reakcím jsou molekuly dostatečně stabilní, což umožňuje intenzivní vědeckou analýzu.
Typy síťovacích činidel
Existují tři různé typy síťovacích činidel – homobifunkční, heterobifunkční a fotoreaktivní síťovací činidla. Jak se tyto typy síťovacích činidel od sebe liší a jak poznáte, které z nich použít pro konkrétní aplikaci? Zde je několik věcí, které možná budete muset vzít v úvahu při výběru vhodného síťovacího činidla.
Homobifunkční síťovací činidla mají na obou koncích identické reaktivní skupiny a obvykle se používají při vázání podobných funkčních skupin. Tato činidla se používají hlavně k tvorbě intramolekulárních příčných vazeb a lze je použít při přípravě polymerů z monomerů. Tento typ činidel sice může zachytit obecný přehled všech interakcí proteinů, ale nemůže poskytnout přesnost požadovanou pro jiné typy aplikací síťování.
Mezi běžné příklady amin-to-aminových síťovacích činidel patří disukcinimidyl suberát neboli DSS (ideální pro síťování receptorového ligandu), disukcinimidyl tartrát neboli DST (používaný pro aplikace, kde je požadováno štěpení příčných vazeb při zachování neporušených disulfidických vazeb proteinů) a dithiobis sukcinimidyl propionát, (ideálně se používá pro zesíťování intracelulárních proteinů před buněčnou lýzou a imunoprecipitací a také pro fixaci proteinových interakcí před identifikací slabých nebo přechodných proteinových interakcí). Mezi běžné příklady sulfhydryl-sulfhydrylových síťovacích činidel patří BMOE a DTME.
Heterobifunkční síťovací činidla mají dvě různé reaktivní skupiny a lze je použít k propojení různorodých funkčních skupin. Tato činidla se používají k výrobě vícenásobných mezimolekulárních síťových vazeb a konjugátů s použitím různorodých biomolekul. Na rozdíl od homobifunkčních síťovacích činidel, která umožňují pouze jednostupňovou konjugaci molekul, heterobifunkční síťovací činidla umožňují dvoustupňovou konjugaci. Tím se minimalizuje nežádoucí polymerace nebo samokonjugace.
Fotoreaktivní síťovací činidla jsou heterobifunkční síťovače, které se stávají reaktivními pouze po vystavení ultrafialovému nebo viditelnému světlu. Tento typ síťovacích činidel se nejlépe používá pro nespecifickou biokonjugaci a lze je použít k vazbě nukleových kyselin, proteinů a dalších molekulárních struktur. Existují dvě fotoreaktivní chemické skupiny, které se hojně používají v proteinových laboratořích po celém světě – aryl-azidy a diaziriny.
Aryl-azidy (N-((2-pyridyldithio)ethyl)-4-azidosalicylamid) jsou nejpoužívanější fotoreaktivní činidla v síťovacích reakcích. Po vystavení UV záření o vlnové délce 250-350 nm mohou tato činidla usnadnit tvorbu nitrenové skupiny, která může spustit adiční reakci s dvojnými vazbami. Kromě toho mohou tato síťovací činidla iniciovat vznik produktů C-H inzerce nebo reagovat s nukleofilem. Mezi běžná síťovací činidla, která patří do této skupiny, patří ANB-NOS (N-5-Azido-2-nitrobenzyloxysukcinimid) a Sulfo-SANPAH.
Na druhé straně NHS-esterové diaziriny nebo azipentanoáty obsahují fotoaktivovatelný diazirinový kruh a N-hydroxysukcinimidový (NHS) ester, který účinně reaguje s primárními aminoskupinami v neutrálních až bazických pufrech (pH 7 až 9) za vzniku stabilních amidových vazeb. Vykazuje lepší fotostabilitu ve srovnání s fenyl azidovou skupinou a může být snadno aktivován dlouhovlnným ultrafialovým světlem (330 až 370 nm) za vzniku karbenových meziproduktů, které vytvářejí kovalentní vazby s jakoukoli peptidovou páteří nebo postranními řetězci aminokyselin ve vzdálenosti distančního ramene
.