A térhálósító reagenseket vagy térhálósítószereket két vagy több fehérjemolekula kovalens kötésére használják, hogy megkönnyítsék a közeli szomszédos fehérjék közötti kapcsolatok, a ligandum-receptor kölcsönhatások, a háromdimenziós fehérjeszerkezetek és a sejtmembránokban lévő molekuláris társulások azonosítását. Ugyanígy felhasználhatók nukleinsavak, gyógyszerek és szilárd felületek módosítására, valamint antitest-enzim konjugátumok és immunotoxinok előállítására is.
Hogyan képesek ezek a reagensek mindezekre? Egyszerűen. A fehérjéket keresztkötő reagensek jellemzően két vagy több kémiailag reaktív csoportot tartalmaznak, amelyek a fehérjékben és más molekulákban található funkciós csoportokhoz (pl. primer aminokhoz, szulfhidrinekhez, karbonylokhoz, szénhidrátokhoz és karbonsavakhoz) kapcsolódnak. Ezek a reakciók eléggé stabillá teszik a molekulákat ahhoz, hogy intenzív tudományos elemzést tegyenek lehetővé.
A térhálósító reagensek típusai
A térhálósító reagenseknek három különböző típusa létezik: homobifunkciós, heterobifunkciós és fotoreaktív térhálósító reagensek. Miben különböznek egymástól ezek a típusú térhálósító reagensek, és honnan tudja, hogy melyiket használja az adott alkalmazáshoz? Íme néhány dolog, amit figyelembe kell vennie a megfelelő térhálósító kiválasztásakor.
A homobifunkcionális térhálósító reagensek mindkét végén azonos reaktív csoportokkal rendelkeznek, és általában hasonló funkciós csoportok megkötésére használják őket. Ezeket a reagenseket elsősorban intramolekuláris keresztkötések kialakítására használják, és monomerekből polimerek előállítására használhatók. Bár az ilyen típusú reagensek képesek általános pillanatfelvételt készíteni az összes fehérje kölcsönhatásról, nem tudják biztosítani a keresztkötések más típusú alkalmazásaihoz szükséges pontosságot.
Az amin-amin térhálósítók néhány gyakori példája a diszukcinimidil-szuberát vagy DSS (ideális receptor ligandok térhálósításához), a diszukcinimidil-tartarát vagy DST (olyan alkalmazásokban használják, ahol a térhálós kötések felbonthatóságára van szükség a fehérje diszulfidkötések épségben tartása mellett) és a ditiobisz-szukcinimidil-propionát, vagy DSP (ideálisan alkalmazható intracelluláris fehérjék keresztkötésére sejtlízis és immunprecipitáció előtt, valamint fehérje kölcsönhatások rögzítésére a gyenge vagy átmeneti fehérje kölcsönhatások azonosítása előtt). Néhány gyakori példa a szulfhidril-szulfhidril-keresztkötőkre a BMOE és a DTME.
A heterobifunkcionális keresztkötő reagensek két különböző reaktív csoporttal rendelkeznek, és különböző funkcionális csoportok összekapcsolására használhatók. Ezeket a reagenseket többszörös intermolekuláris keresztkötések és konjugátumok előállítására használják különböző biomolekulák felhasználásával. A homobifunkciós keresztkötőktől eltérően, amelyek csupán a molekulák egylépéses konjugálását teszik lehetővé, a heterobifunkciós keresztkötők kétlépéses konjugációt tesznek lehetővé. Ez minimalizálja a nemkívánatos polimerizációt vagy önkonjugációt.
A fotoreaktív térhálósító reagensek olyan heterobifunkcionális térhálósítók, amelyek csak ultraibolya vagy látható fény hatására válnak reaktívvá. Ez a fajta térhálósító reagens leginkább nem specifikus biokonjugációra használható, és nukleinsavak, fehérjék és más molekuláris struktúrák megkötésére használható. Két fotoreaktív kémiai csoport van, amelyeket világszerte széles körben használnak a fehérje laboratóriumokban: az aril-azidok és a diazirinek.
Az aril-azidok (N-((2-piridil-ditio)etil)-4-azidosalicilamid) a legszélesebb körben használt fotoreaktív reagensek a keresztkötési reakciókban. A 250-350 nm-es UV-fénynek való kitettség hatására ezek a reagensek elősegíthetik egy nitréncsoport kialakulását, amely addíciós reakciót indíthat el a kettős kötésekkel. Ezenkívül ezek a térhálósítószerek C-H inszerciós termékek keletkezését indíthatják el, vagy nukleofillal reagálhatnak. Néhány gyakori, ebbe a csoportba tartozó térhálósító reagens az ANB-NOS (N-5-Azido-2-nitrobenziloxiszukcinimid) és a Sulfo-SANPAH.
Az NHS-észter diazirinek vagy azipentanoátok viszont egy fotoaktiválható diazirin gyűrűt és egy N-hidroxiszukcinimid (NHS) észtert tartalmaznak, amely semleges vagy bázikus pufferekben (pH 7-9) hatékonyan reagál elsődleges aminocsoportokkal, stabil amidkötéseket képezve. A fenil-azid csoporthoz képest jobb fotostabilitást mutat, és könnyen aktiválható hosszúhullámú ultraibolya fénnyel (330-370 nm), hogy olyan karben intermediereket hozzon létre, amelyek kovalens kötéseket képeznek bármely peptidgerinccel vagy aminosav-oldallánccal a távtartó kar távolságán belül.