I reagenti di crosslinking o reticolanti sono usati per legare covalentemente due o più molecole proteiche per facilitare l’identificazione di relazioni tra proteine vicine, interazioni ligando-recettore, strutture proteiche tridimensionali, e associazioni molecolari nelle membrane cellulari. Allo stesso modo, possono anche essere utilizzati per modificare acidi nucleici, farmaci e superfici solide, e nella preparazione di coniugati anticorpo-enzima e immunotossine.
Come possono questi reagenti fare tutto questo? Semplice. I reagenti di reticolazione delle proteine contengono tipicamente due o più gruppi chimicamente reattivi che si collegano ai gruppi funzionali (per esempio ammine primarie, solfidrilici, carbonili, carboidrati e acidi carbossilici) che si trovano nelle proteine e in altre molecole. Queste reazioni rendono le molecole abbastanza stabili da permettere un’analisi scientifica intensiva.
Tipi di reticolanti
Ci sono tre diversi tipi di reticolanti – reagenti reticolanti omobifunzionali, eterobifunzionali e fotoreattivi. In che modo questi tipi di reticolanti differiscono l’uno dall’altro e come si fa a sapere quale utilizzare per la vostra specifica applicazione? Ecco alcune cose che potresti dover considerare quando scegli un reticolante adatto.
I reagenti reticolanti omofunzionali hanno gruppi reattivi identici alle due estremità e sono generalmente usati per legare gruppi funzionali simili. Questi reagenti sono usati principalmente per formare legami incrociati intramolecolari e possono essere usati nella preparazione di polimeri da monomeri. Mentre questo tipo di reagenti può catturare un’istantanea generale di tutte le interazioni proteiche, non possono fornire la precisione richiesta per altri tipi di applicazioni di crosslinking.
Alcuni esempi comuni di reticolanti ammina-ammina includono il disuccinimidyl suberato o DSS (ideale per la reticolazione del legante del recettore), il disuccinimidyl tartrato o DST (usato per applicazioni in cui è richiesta la scissione del crosslink mantenendo intatti i legami disolfuro della proteina) e il ditiobis succinimidyl propionato, o DSP (idealmente utilizzato per il crosslinking delle proteine intracellulari prima della lisi cellulare e dell’immunoprecipitazione, nonché per fissare le interazioni proteiche prima dell’identificazione di interazioni proteiche deboli o transitorie). Alcuni esempi comuni di reticolanti da solfidrilico a solfidrilico includono BMOE e DTME.
I reagenti di reticolazione eterobifunzionali possiedono due diversi gruppi reattivi e possono essere utilizzati per collegare gruppi funzionali dissimili. Questi reagenti sono usati per produrre legami incrociati intermolecolari multipli e coniugati usando biomolecole dissimili. A differenza dei reticolanti omofunzionali che si limitano a facilitare la coniugazione di molecole in una sola fase, i reticolanti eterobifunzionali permettono coniugazioni in due fasi. Questo minimizza la polimerizzazione indesiderata o l’auto-coniugazione.
I reagenti reticolanti fotoreattivi sono reticolanti eterobifunzionali che diventano reattivi solo dopo l’esposizione alla luce ultravioletta o visibile. Questo tipo di reagente di reticolazione è utilizzato al meglio per la bioconiugazione non specifica e può essere usato per legare acidi nucleici, proteine e altre strutture molecolari. Ci sono due gruppi chimici fotoreattivi che sono ampiamente utilizzati nei laboratori di proteine in tutto il mondo – aril-azidi e diazirine.
Le azidi di arile (N-((2-pyridyldithio)ethyl)-4-azidosalicylamide) sono i reagenti fotoreattivi più ampiamente utilizzati nelle reazioni di reticolazione. Dopo l’esposizione alla luce UV di 250-350 nm, questi reagenti possono facilitare la formazione di un gruppo nitrenico che può innescare una reazione di addizione con i doppi legami. Inoltre, questi reticolanti possono avviare la produzione di prodotti di inserzione C-H o reagire con un nucleofilo. Alcuni reagenti di reticolazione comuni che appartengono a questo gruppo includono ANB-NOS (N-5-Azido-2-nitrobenzyloxysuccinimide) e Sulfo-SANPAH.
D’altra parte, le diazirine NHS-estere o azipentanoates contengono un anello diazirino fotoattivabile e un estere N-hydroxysuccinimide (NHS) che reagisce efficacemente con gruppi amminici primari in tamponi da neutri a basici (pH 7 a 9) per formare legami amidici stabili. Esibisce una migliore fotostabilità rispetto al gruppo fenil azide e può essere facilmente attivato con la luce ultravioletta a onda lunga (da 330 a 370nm) per produrre intermedi carbenici che formano legami covalenti con qualsiasi backbone peptidico o catene laterali di aminoacidi entro la distanza del braccio spaziatore.