Los reactivos de reticulación o reticuladores se utilizan para unir covalentemente dos o más moléculas de proteínas con el fin de facilitar la identificación de relaciones entre proteínas cercanas, interacciones ligando-receptor, estructuras tridimensionales de proteínas y asociaciones moleculares en las membranas celulares. Del mismo modo, también pueden utilizarse para modificar ácidos nucleicos, fármacos y superficies sólidas, y en la preparación de conjugados anticuerpo-enzima e inmunotoxinas.
¿Cómo pueden hacer todo esto estos reactivos? Sencillo. Los reactivos de reticulación de proteínas suelen contener dos o más grupos químicamente reactivos que se conectarán a los grupos funcionales (por ejemplo, aminas primarias, sulfhidrilos, carbonilos, carbohidratos y ácidos carboxílicos) que se encuentran en las proteínas y otras moléculas. Estas reacciones hacen que las moléculas sean lo suficientemente estables como para permitir un análisis científico intensivo.
Tipos de reactivos reticulantes
Hay tres tipos diferentes de reticulantes: homobifuncionales, heterobifuncionales y reactivos reticulantes fotorreactivos. ¿En qué se diferencian estos tipos de reticulantes y cómo saber cuál utilizar para su aplicación específica? A continuación se indican algunos aspectos que debe tener en cuenta a la hora de elegir un reticulante adecuado.
Los reactivos de reticulación homobifuncionales tienen grupos reactivos idénticos en ambos extremos y se utilizan generalmente en la unión de grupos funcionales similares. Estos reactivos se utilizan principalmente para formar enlaces cruzados intramoleculares y pueden utilizarse en la preparación de polímeros a partir de monómeros. Si bien este tipo de reactivos puede capturar una instantánea general de todas las interacciones proteicas, no pueden proporcionar la precisión requerida para otros tipos de aplicaciones de reticulación.
Algunos ejemplos comunes de reticulantes amina-amina incluyen el suberato de disuccinimidilo o DSS (ideal para la reticulación de ligandos de receptores), el tartrato de disuccinimidilo o DST (utilizado para aplicaciones en las que se requiere la capacidad de escisión del reticulado mientras se mantienen intactos los enlaces disulfuro de las proteínas) y el propionato de ditiobis succinimidilo o DSP (utilizado idealmente para la reticulación de proteínas intracelulares antes de la lisis celular y la inmunoprecipitación, así como para la fijación de interacciones proteicas antes de la identificación de interacciones proteicas débiles o transitorias). Algunos ejemplos comunes de reticuladores de sulfhidrilo a sulfhidrilo incluyen el BMOE y el DTME.
Los reactivos de reticulación heterobifuncionales poseen dos grupos reactivos diferentes y pueden utilizarse para unir grupos funcionales disímiles. Estos reactivos se utilizan para producir múltiples enlaces cruzados intermoleculares y conjugados utilizando biomoléculas disímiles. A diferencia de los reticulantes homobifuncionales que sólo facilitan la conjugación de moléculas en un solo paso, los reticulantes heterobifuncionales permiten realizar conjugaciones en dos etapas. Esto minimiza la polimerización indeseable o la autoconjugación.
Los reactivos de reticulación fotorreactivos son reticuladores heterobifuncionales que se vuelven reactivos sólo al exponerse a la luz ultravioleta o visible. Este tipo de reactivo de reticulación se utiliza mejor para la bioconjugación no específica y puede utilizarse para unir ácidos nucleicos, proteínas y otras estructuras moleculares. Hay dos grupos químicos fotorreactivos que se utilizan ampliamente en los laboratorios de proteínas de todo el mundo: las aril-azidas y las diazirinas.
Las aril-azidas (N-((2-piridilditio)etil)-4-azidosalicilamida) son los reactivos fotorreactivos más utilizados en las reacciones de reticulación. Tras la exposición a la luz UV de 250-350 nm, estos reactivos pueden facilitar la formación de un grupo nitreno que puede desencadenar una reacción de adición con los dobles enlaces. Además, estos reticulantes pueden iniciar la producción de productos de inserción C-H o reaccionar con un nucleófilo. Algunos reactivos de reticulación comunes que pertenecen a este grupo incluyen ANB-NOS (N-5-Azido-2-nitrobenziloxisuccinimida) y Sulfo-SANPAH.
Por otra parte, las diazirinas o azipentanoatos de ésteres de NHS contienen un anillo de diazirina fotoactivable y un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) que reacciona eficazmente con grupos amino primarios en tampones neutros a básicos (pH 7 a 9) para formar enlaces amídicos estables. Presenta una mejor fotoestabilidad en comparación con el grupo fenil azida y puede activarse fácilmente con luz ultravioleta de onda larga (330 a 370 nm) para producir intermedios de carbeno que forman enlaces covalentes con cualquier columna vertebral de péptidos o cadenas laterales de aminoácidos dentro de la distancia del brazo espaciador.