Krydsningsreagenser eller krydsningsreagenser bruges til at binde to eller flere proteinmolekyler kovalent for at lette identifikationen af relationer mellem nærtstående proteiner, ligand-receptor-interaktioner, tredimensionelle proteinstrukturer og molekylære forbindelser i cellemembraner. På samme måde kan de også anvendes til at modificere nukleinsyrer, lægemidler og faste overflader og til fremstilling af antistof-enzymkonjugater og immunotoksiner.
Hvordan kan disse reagenser gøre alt dette? Enkelt. Reagenser til tværbinding af proteiner indeholder typisk to eller flere kemisk reaktive grupper, som vil forbinde sig med de funktionelle grupper (f.eks. primære aminer, sulfhydryler, carbonyler, kulhydrater og carboxylsyrer), der findes i proteiner og andre molekyler. Disse reaktioner gør molekylerne stabile nok til at muliggøre intensive videnskabelige analyser.
Typer af tværbindingsreagenser
Der findes tre forskellige typer af tværbindingsreagenser – homobifunktionelle, heterobifunktionelle og fotoreaktive tværbindingsreagenser. Hvordan adskiller disse typer af tværbindingsreagenser sig fra hinanden, og hvordan ved du, hvilken type du skal bruge til din specifikke anvendelse? Her er nogle ting, som du måske skal overveje, når du vælger et passende tværbindingsmiddel.
Homobifunktionelle tværbindingsreagenser har identiske reaktive grupper i begge ender og bruges generelt til at binde lignende funktionelle grupper. Disse reagenser anvendes hovedsagelig til at danne intramolekylære tværbindinger og kan anvendes til fremstilling af polymerer fra monomerer. Selv om denne type reagenser kan give et generelt øjebliksbillede af alle proteininteraktioner, kan de ikke give den nøjagtighed, der er nødvendig for andre typer krydsbindingsapplikationer.
Nogle almindelige eksempler på amin-til-amin-crosslinkere omfatter disuccinimidylsuberat eller DSS (ideelt til krydsbinding af receptorligander), disuccinimidyltartrat eller DST (anvendes til anvendelser, hvor der kræves krydsbindingsspaltbarhed, samtidig med at proteindisulfidbindingerne bevares intakte) og dithiobis succinimidylpropionat, eller DSP (anvendes ideelt til tværbinding af intracellulære proteiner forud for cellelysis og immunoprecipitation samt til fastgørelse af proteininteraktioner forud for identifikation af svage eller forbigående proteininteraktioner). Nogle almindelige eksempler på sulfhydryl-til-sulfhydryl-krydsningsreagenser omfatter BMOE og DTME.
Heterobifunktionelle krydsningsreagenser har to forskellige reaktive grupper og kan anvendes til at forbinde forskellige funktionelle grupper. Disse reagenser anvendes til at fremstille flere intermolekylære krydsforbindelser og konjugater ved hjælp af forskellige biomolekyler. I modsætning til homobifunktionelle crosslinkere, der kun muliggør konjugering af molekyler i et enkelt trin, giver heterobifunktionelle crosslinkere mulighed for konjugering i to trin. Dette minimerer uønsket polymerisering eller selvkonjugering.
Fotoreaktive tværbindingsreagenser er heterobifunktionelle tværbindingsreagenser, der kun bliver reaktive ved eksponering for ultraviolet eller synligt lys. Denne type krydsbindingsreagens anvendes bedst til uspecifik biokonjugering og kan bruges til at binde nukleinsyrer, proteiner og andre molekylære strukturer. Der er to fotoreaktive kemiske grupper, der anvendes i vid udstrækning i proteinlaboratorier verden over – aryl-azider og diaziriner.
Arylazider (N-((2-pyridyldithio)ethyl)-4-azidosalicylamid) er de mest udbredte fotoreaktive reagenser i krydsningsreaktioner. Ved eksponering for 250-350 nm UV-lys kan disse reagenser lette dannelsen af en nitrengruppe, som kan udløse en additionsreaktion med dobbeltbindingerne. Desuden kan disse tværbindingsmidler udløse dannelsen af C-H-indsætningsprodukter eller reagere med en nukleofil. Nogle almindelige tværbindingsreagenser, der tilhører denne gruppe, omfatter ANB-NOS (N-5-Azido-2-nitrobenzyloxysuccinimid) og Sulfo-SANPAH.
På den anden side indeholder NHS-esterdiaziriner eller azipentanoater en fotoaktiverbar diazirinring og en N-hydroxysuccinimid (NHS)-ester, som reagerer effektivt med primære aminogrupper i neutrale til basiske buffere (pH 7 til 9) for at danne stabile amidbindinger. Den udviser bedre fotostabilitet sammenlignet med phenylazidgruppen og kan let aktiveres med langbølget ultraviolet lys (330 til 370 nm) for at producere carbenintermediater, der danner kovalente bindinger med enhver peptidrygge eller aminosyresidekæde inden for afstanden til spacerarmen.