Vernetzungsreagenzien oder Crosslinker werden zur kovalenten Bindung von zwei oder mehr Proteinmolekülen verwendet, um die Identifizierung von Beziehungen zwischen benachbarten Proteinen, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen, dreidimensionalen Proteinstrukturen und molekularen Verbindungen in Zellmembranen zu erleichtern. In gleicher Weise können sie auch zur Modifizierung von Nukleinsäuren, Arzneimitteln und festen Oberflächen sowie bei der Herstellung von Antikörper-Enzym-Konjugaten und Immuntoxinen verwendet werden.
Wie können diese Reagenzien all dies leisten? Ganz einfach. Proteinvernetzungsreagenzien enthalten in der Regel zwei oder mehr chemisch reaktive Gruppen, die sich mit den funktionellen Gruppen (z. B. primäre Amine, Sulfhydrylate, Carbonylgruppen, Kohlenhydrate und Carbonsäuren) in Proteinen und anderen Molekülen verbinden. Diese Reaktionen machen die Moleküle stabil genug, um eine intensive wissenschaftliche Analyse zu ermöglichen.
Typen von Vernetzungsreagenzien
Es gibt drei verschiedene Arten von Vernetzern – homobifunktionelle, heterobifunktionelle und photoreaktive Vernetzungsreagenzien. Wie unterscheiden sich diese Arten von Vernetzern voneinander und woher wissen Sie, welchen Sie für Ihre spezielle Anwendung verwenden sollten? Hier sind einige Dinge, die Sie bei der Auswahl eines geeigneten Vernetzers berücksichtigen sollten.
Homobifunktionelle Vernetzungsreagenzien haben identische reaktive Gruppen an beiden Enden und werden im Allgemeinen zur Bindung ähnlicher funktioneller Gruppen verwendet. Diese Reagenzien werden hauptsächlich zur Bildung intramolekularer Vernetzungen eingesetzt und können bei der Herstellung von Polymeren aus Monomeren verwendet werden. Während diese Art von Reagenzien eine allgemeine Momentaufnahme aller Proteininteraktionen erfassen kann, können sie nicht die für andere Arten von Vernetzungsanwendungen erforderliche Genauigkeit bieten.
Einige gängige Beispiele für Amin-zu-Amin-Vernetzer sind Disuccinimidylsuberat oder DSS (ideal für die Vernetzung von Rezeptorliganden), Disuccinimidyltartrat oder DST (für Anwendungen, bei denen die Spaltbarkeit der Vernetzung erforderlich ist, während die Proteindisulfidbindungen intakt bleiben) und Dithiobis-Succinimidylpropionat, oder DSP (ideal für die Vernetzung intrazellulärer Proteine vor der Zelllyse und Immunpräzipitation sowie für die Fixierung von Proteininteraktionen vor der Identifizierung schwacher oder vorübergehender Proteininteraktionen). Einige gängige Beispiele für Sulfhydryl-zu-Sulfhydryl-Vernetzer sind BMOE und DTME.
Heterobifunktionelle Vernetzungsreagenzien besitzen zwei verschiedene reaktive Gruppen und können zur Verknüpfung unterschiedlicher funktioneller Gruppen verwendet werden. Diese Reagenzien werden zur Herstellung multipler intermolekularer Vernetzungen und Konjugate mit unterschiedlichen Biomolekülen verwendet. Im Gegensatz zu homobifunktionellen Vernetzern, die lediglich eine einstufige Konjugation von Molekülen ermöglichen, erlauben heterobifunktionelle Vernetzer zweistufige Konjugationen. Dadurch wird eine unerwünschte Polymerisation oder Selbstkonjugation minimiert.
Fotoreaktive Vernetzungsreagenzien sind heterobifunktionelle Vernetzer, die erst bei Einwirkung von ultraviolettem oder sichtbarem Licht reaktiv werden. Diese Art von Vernetzungsreagenzien eignet sich am besten für die unspezifische Biokonjugation und kann zur Bindung von Nukleinsäuren, Proteinen und anderen Molekülstrukturen verwendet werden. Es gibt zwei photoreaktive chemische Gruppen, die in Proteinlabors weltweit weit verbreitet sind – Arylazide und Diazirine.
Arylazide (N-((2-Pyridyldithio)ethyl)-4-azidosalicylamid) sind die am häufigsten verwendeten photoreaktiven Reagenzien bei Vernetzungsreaktionen. Bei Bestrahlung mit UV-Licht (250-350 nm) können diese Reagenzien die Bildung einer Nitrengruppe fördern, die eine Additionsreaktion mit den Doppelbindungen auslösen kann. Außerdem können diese Vernetzer die Bildung von C-H-Insertionsprodukten auslösen oder mit einem Nukleophil reagieren. Einige gängige Vernetzungsreagenzien, die zu dieser Gruppe gehören, sind ANB-NOS (N-5-Azido-2-nitrobenzyloxysuccinimid) und Sulfo-SANPAH.
Andererseits enthalten NHS-Ester-Diazirine oder -Azipentanoate einen photoaktivierbaren Diazirinring und einen N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester, der in neutralen bis basischen Puffern (pH 7 bis 9) effizient mit primären Aminogruppen reagiert und stabile Amidbindungen bildet. Es weist im Vergleich zur Phenylazidgruppe eine bessere Photostabilität auf und kann leicht mit langwelligem ultraviolettem Licht (330 bis 370 nm) aktiviert werden, um Carben-Zwischenprodukte zu erzeugen, die kovalente Bindungen mit beliebigen Peptidrückgraten oder Aminosäureseitenketten innerhalb des Spacerarmabstands bilden.