Les réactifs de réticulation ou réticulants sont utilisés pour lier de manière covalente deux ou plusieurs molécules de protéines afin de faciliter l’identification des relations entre les protéines proches, les interactions ligand-récepteur, les structures protéiques tridimensionnelles et les associations moléculaires dans les membranes cellulaires. De la même manière, ils peuvent également être utilisés pour modifier des acides nucléiques, des médicaments et des surfaces solides, ainsi que dans la préparation de conjugués anticorps-enzyme et d’immunotoxines.
Comment ces réactifs peuvent-ils faire tout cela ? C’est simple. Les réactifs de réticulation des protéines contiennent généralement deux ou plusieurs groupes chimiquement réactifs qui vont se connecter aux groupes fonctionnels (par exemple, les amines primaires, les sulfhydryles, les carbonyles, les hydrates de carbone et les acides carboxyliques) présents dans les protéines et autres molécules. Ces réactions rendent les molécules suffisamment stables pour permettre une analyse scientifique intensive.
Types de réactifs de réticulation
Il existe trois différents types de réticulants – les réactifs de réticulation homobifonctionnels, hétérobifonctionnels et photoréactifs. Comment ces types de réticulants diffèrent-ils les uns des autres et comment savoir lequel utiliser pour votre application spécifique ? Voici quelques éléments à prendre en compte pour choisir un réticulant adapté.
Les réactifs de réticulation homobifonctionnels ont des groupes réactifs identiques à chaque extrémité et sont généralement utilisés pour lier des groupes fonctionnels similaires. Ces réactifs sont principalement utilisés pour former des réticulations intramoléculaires et peuvent être utilisés dans la préparation de polymères à partir de monomères. Bien que ce type de réactifs puisse capturer un instantané général de toutes les interactions protéiques, ils ne peuvent pas fournir la précision requise pour d’autres types d’applications de réticulation.
Certains exemples courants d’agents de réticulation amine-amine comprennent le subérate de disuccinimidyle ou DSS (idéal pour la réticulation de ligands de récepteurs), le tartrate de disuccinimidyle ou DST (utilisé pour les applications dans lesquelles la clivabilité de la réticulation est requise tout en gardant les liaisons disulfure des protéines intactes) et le propionate de dithiobis succinimidyle, ou DSP (idéalement utilisé pour la réticulation des protéines intracellulaires avant la lyse cellulaire et l’immunoprécipitation ainsi que pour la fixation des interactions protéiques avant l’identification des interactions protéiques faibles ou transitoires). Certains exemples courants de réticulants sulfhydryl-to-sulfhydryl comprennent le BMOE et le DTME.
Les réactifs de réticulation hétérobifonctionnels possèdent deux groupes réactifs différents et peuvent être utilisés pour relier des groupes fonctionnels dissemblables. Ces réactifs sont utilisés pour produire de multiples réticulations intermoléculaires et des conjugués en utilisant des biomolécules dissemblables. Contrairement aux agents de réticulation homobifonctionnels qui facilitent simplement la conjugaison des molécules en une seule étape, les agents de réticulation hétérobifonctionnels permettent des conjugaisons en deux étapes. Cela minimise la polymérisation indésirable ou l’auto-conjugaison.
Les réactifs de réticulation photoréactifs sont des réticulants hétérobifonctionnels qui ne deviennent réactifs que par exposition à la lumière ultraviolette ou visible. Ce type de réactif de réticulation est mieux utilisé pour la bioconjugaison non spécifique et peut être utilisé pour lier des acides nucléiques, des protéines et d’autres structures moléculaires. Il existe deux groupes chimiques photoréactifs qui sont largement utilisés dans les laboratoires de protéines du monde entier – les aryl-azides et les diazirines.
Les aryl-azides (N-((2-pyridyldithio)éthyl)-4-azidosalicylamide) sont les réactifs photoréactifs les plus utilisés dans les réactions de réticulation. Lors de l’exposition à la lumière UV de 250-350nm, ces réactifs peuvent faciliter la formation d’un groupe nitrène qui peut déclencher une réaction d’addition avec les doubles liaisons. De plus, ces réticulants peuvent initier la production de produits d’insertion C-H ou réagir avec un nucléophile. Certains réactifs de réticulation communs qui appartiennent à ce groupe comprennent ANB-NOS (N-5-Azido-2-nitrobenzyloxysuccinimide) et Sulfo-SANPAH.
D’autre part, les diazirines ou azipentanoates d’ester NHS contiennent un cycle de diazirine photoactivable et un ester N-hydroxysuccinimide (NHS) qui réagit efficacement avec les groupes amino primaires dans des tampons neutres à basiques (pH 7 à 9) pour former des liaisons amides stables. Il présente une meilleure photostabilité par rapport au groupe phényl azide et peut être facilement activé avec une lumière ultraviolette à ondes longues (330 à 370 nm) pour produire des intermédiaires carbènes qui forment des liaisons covalentes avec n’importe quel squelette de peptide ou chaîne latérale d’acide aminé dans la distance du bras espaceur.