Ristisilloitusreagensseja tai ristisilloitusaineita käytetään kahden tai useamman proteiinimolekyylin kovalenttiseen sitomiseen, ja niiden avulla voidaan helpommin tunnistaa läheisten proteiinien välisiä suhteita, ligandi-reseptori-vuorovaikutuksia, kolmiulotteisia proteiinirakenteita ja molekyylien liittymiä solukalvoissa. Samalla tavalla niitä voidaan käyttää myös nukleiinihappojen, lääkkeiden ja kiinteiden pintojen muokkaamiseen sekä vasta-aine-entsyymikonjugaattien ja immunotoksiinien valmistukseen.
Miten nämä reagenssit voivat tehdä kaikkea tätä? Yksinkertaisesti. Proteiinien ristisilloitusreagenssit sisältävät tyypillisesti kaksi tai useampia kemiallisesti reaktiivisia ryhmiä, jotka kytkeytyvät proteiineissa ja muissa molekyyleissä esiintyviin funktionaalisiin ryhmiin (esim. primaarisiin amiineihin, sulfydryyleihin, karbonyyleihin, hiilihydraatteihin ja karboksyylihappoihin). Nämä reaktiot tekevät molekyyleistä riittävän stabiileja, jotta niitä voidaan analysoida intensiivisesti tieteellisesti.
Ristisilloitusreagenssien tyypit
Ristisilloitusreagensseja on kolmea erilaista tyyppiä – homobifunktionaaliset, heterobifunktionaaliset ja fotoreaktiiviset ristisilloitusreagenssit. Miten nämä ristisilloittajatyypit eroavat toisistaan ja miten tiedät, mitä niistä kannattaa käyttää tiettyyn sovellukseen? Seuraavassa on muutamia asioita, jotka sinun on ehkä otettava huomioon, kun valitset sopivaa ristisilloittajaa.
Homobifunktionaalisilla ristisilloitusreagensseilla on identtiset reaktiiviset ryhmät molemmissa päissä, ja niitä käytetään yleensä samanlaisten funktionaalisten ryhmien sitomiseen. Näitä reagensseja käytetään pääasiassa molekyylinsisäisten ristisidosten muodostamiseen, ja niitä voidaan käyttää polymeerien valmistuksessa monomeereistä. Vaikka tämäntyyppisillä reagensseilla voidaankin saada yleinen tilannekuva kaikista proteiinien vuorovaikutuksista, niillä ei voida saavuttaa tarkkuutta, jota tarvitaan muuntyyppisissä ristisilloitussovelluksissa.
Joitakin yleisiä esimerkkejä amiini-amiini-ristikytkentäreagensseista ovat disukkinimidyylisuberaatti eli DSS (ihanteellinen reseptoriligandien ristisilloittamiseen), disukkinimidyylitartraatti eli DST (käytetään sovelluksissa, joissa vaaditaan ristisilloittumisen pilkkoutuvuutta proteiinien disulfidisidisidosten pysyessä koskemattomina) ja ditiobisuksisukkinimidyylipropionaatti, tai DSP (käytetään ihanteellisesti solunsisäisten proteiinien ristisidontaan ennen solujen lyysiä ja immunoprecipitaatiota sekä proteiinien vuorovaikutusten kiinnittämiseen ennen heikkojen tai ohimenevien proteiinien vuorovaikutusten tunnistamista). Joitakin yleisiä esimerkkejä sulfhydryyli-sulfhydryyli-ristikytkentäaineista ovat BMOE ja DTME.
Heterobifunktionaalisilla ristisilloitusreagensseilla on kaksi erilaista reaktiivista ryhmää, ja niitä voidaan käyttää erilaisten funktionaalisten ryhmien yhdistämiseen. Näitä reagensseja käytetään useiden molekyylien välisten ristisidosten ja konjugaattien tuottamiseen käyttämällä erilaisia biomolekyylejä. Toisin kuin homobifunktionaaliset ristisilloittimet, jotka helpottavat molekyylien konjugointia vain yhdessä vaiheessa, heterobifunktionaaliset ristisilloittimet mahdollistavat kaksivaiheiset konjugaatiot. Tämä minimoi ei-toivotun polymerisaation tai itsekytkeytymisen.
Fotoreaktiiviset ristisilloitusreagenssit ovat heterobifunktionaalisia ristisilloittajia, jotka muuttuvat reaktiivisiksi vain altistuessaan ultravioletti- tai näkyvälle valolle. Tämäntyyppisiä ristisilloitusreagensseja käytetään parhaiten epäspesifiseen biokonjugaatioon, ja niitä voidaan käyttää nukleiinihappojen, proteiinien ja muiden molekyylirakenteiden sitomiseen. On olemassa kaksi fotoreaktiivista kemiallista ryhmää, joita käytetään laajalti proteiinilaboratorioissa maailmanlaajuisesti: aryyliatsidit ja diatsiriinit.
Aryyliatsidit (N-((2-pyridyyliditio)etyyli)-4-atsidosalisyyliamidi) ovat yleisimmin käytettyjä fotoreaktiivisia reagensseja ristisilloitusreaktioissa. Kun nämä reagenssit altistetaan 250-350 nm:n UV-valolle, ne voivat helpottaa nitreeniryhmän muodostumista, joka voi käynnistää additioreaktion kaksoissidosten kanssa. Lisäksi nämä ristisilloittajat voivat käynnistää C-H-insertiotuotteiden muodostumisen tai reagoida nukleofiilin kanssa. Joitakin yleisiä tähän ryhmään kuuluvia ristisilloitusreagensseja ovat ANB-NOS (N-5-Azido-2-nitrobenzyloxysuccinimidi) ja Sulfo-SANPAH.
Toisaalta NHS-esteridiatsiriinit tai atsipentanoaatit sisältävät valo-aktivoituvan diatsiriinirenkaan ja N-hydroxysuccinimidi-(NHS-)esterin, joka reagoi tehokkaasti neutraaleissa tai emäksisissä puskurisäiliöissä (pH 7-9) primaaristen aminoryhmien kanssa muodostaen stabiileja amidisidoksia. Sillä on parempi fotostabiilisuus verrattuna fenyyliatsidiryhmään, ja se voidaan helposti aktivoida pitkäaaltoisella ultraviolettivalolla (330-370 nm) tuottamaan karbeeniväliaineita, jotka muodostavat kovalenttisia sidoksia minkä tahansa peptidin selkärangan tai aminohapon sivuketjujen kanssa välivarren etäisyydellä.