架橋試薬または架橋剤は、近接するタンパク質間の関係、リガンド-受容体相互作用、タンパク質の3次元構造、細胞膜の分子会合などを特定するために、2つ以上のタンパク質分子を共有結合するために使用されます。 同様に、核酸、薬物、固体表面の修飾や、抗体・酵素結合体、免疫毒素の調製にも用いることができる。
これらの試薬は、なぜこれらすべてを行うことができるのでしょうか？ 簡単です。 タンパク質架橋試薬は通常、タンパク質や他の分子に見られる官能基（一級アミン、スルフヒドリル、カルボニル、炭水化物、カルボン酸など）に自ら接続する2つ以上の化学反応性基を含んでいる。 これらの反応により、分子は科学的な集中分析ができるほど安定になります。
架橋試薬の種類
架橋試薬には、ホモ二官能性、ヘテロ二官能性、光反応性架橋試薬という3種類のものがあります。 これらの架橋剤の違いは何でしょうか。また、特定のアプリケーションにどの架橋剤を使用すればよいかを知るにはどうすればよいでしょうか。 ここでは、適切な架橋剤を選択する際に考慮すべき点をいくつか紹介します。
ホモ二官能性架橋試薬は、両端に同一の反応基を持ち、一般に同様の官能基を結合する際に使用されます。 これらの試薬は主に分子内架橋を形成するために用いられ、モノマーからポリマーを調製する際に使用することができる。 このタイプの試薬は、すべてのタンパク質相互作用の一般的なスナップショットを捉えることができますが、他のタイプの架橋アプリケーションに必要な精度を提供することはできません。
アミン-アミン架橋剤の一般的な例としては、ジスクシンイミジルスベレートまたはDSS（受容体リガンド架橋に最適）、ジスクシンイミジルタートまたはDST（タンパク質ジスルフィド結合を維持しながら架橋切断性が求められる用途に使用）およびジチオビスクシンイミジルプロピオネートなどがある。 DSP（理想的には、細胞溶解や免疫沈降の前に細胞内タンパク質を架橋したり、弱いまたは一過性のタンパク質相互作用を同定する前にタンパク質相互作用を固定するために使用される）。 スルフヒドリル-スルフヒドリル架橋剤の一般的な例としては、BMOEおよびDTMEが挙げられる。
ヘテロ二官能性架橋試薬は2種類の反応基を持ち、異種の官能基を連結するために使用することが可能である。 この試薬は、異種の生体分子を用いて複数の分子間架橋やコンジュゲートを生成するために使用される。 ホモ二官能性架橋剤が一段階のコンジュゲーションしかできないのに対して、ヘテロ二官能性架橋剤は二段階のコンジュゲーションを可能にする。 光反応性架橋剤は、紫外光や可視光にさらされたときのみ反応性を示すヘテロ二官能性架橋剤であり、光反応性架橋剤を使用することで、分子間の相互作用を最小限に抑えることができます。 このタイプの架橋試薬は、非特異的なバイオコンジュゲーションに最適で、核酸、タンパク質、その他の分子構造の結合に使用することができる。
アリールアジド (N-((2-pyridyldithio)ethyl)-4-azidosalicylamide) は、架橋反応において最も広く使用されている光反応性試薬であり、世界中のタンパク研究室で広く使用されている2種類の光反応性化学グループがあります。 250-350nmの紫外線を照射すると、二重結合との付加反応を引き起こすニトレン基の生成を促進することができる。 さらに、これらの架橋剤は、C-H挿入生成物の生成を開始したり、求核剤と反応することもある。 このグループに属する一般的な架橋剤には、ANB-NOS (N-5-Azido-2-nitrobenzyloxysuccinimide) やSulfo-SANPAHがある。
一方、NHS-ester diazirines or azipentanoatesは光活性化ジアジリン環とNHS (Hydroxysuccinimide) エステルを含み、中性～塩基性緩衝液 (pH 7 ～ 9) で一次アミノ基と効率的に反応して安定したアミド結合を形成する。 フェニルアジド基に比べて光安定性が高く、長波長紫外線（330〜370nm）で容易に活性化されてカルベン中間体を生成し、スペーサーアーム距離内の任意のペプチドバックボーンやアミノ酸側鎖と共有結合を形成します
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