Crosslinking reagentia of crosslinkers worden gebruikt om twee of meer eiwitmoleculen covalent te binden om de identificatie te vergemakkelijken van relaties tussen nabije eiwitten, ligand-receptor interacties, driedimensionale eiwitstructuren en moleculaire associaties in celmembranen. Op dezelfde wijze kunnen zij ook worden gebruikt voor het modificeren van nucleïnezuren, geneesmiddelen en vaste oppervlakken, en bij de bereiding van antilichaam-enzymconjugaten en immunotoxinen.
Hoe kunnen deze reagentia dit allemaal doen? Eenvoudig. Eiwit crosslinking reagentia bevatten meestal twee of meer chemisch reactieve groepen die zich verbinden met de functionele groepen (b.v. primaire aminen, sulfhydryls, carbonyls, koolhydraten en carboxylzuren) die in eiwitten en andere moleculen voorkomen. Deze reacties maken de moleculen stabiel genoeg om intensieve wetenschappelijke analyse mogelijk te maken.
Typen crosslinking Reagentia
Er zijn drie verschillende typen crosslinkers – homobifunctionele, heterobifunctionele, en fotoreactieve crosslinking reagentia. Hoe verschillen deze soorten crosslinkers van elkaar en hoe weet u welke u moet gebruiken voor uw specifieke toepassing? Hier zijn enkele dingen die u mogelijk moet overwegen bij het kiezen van een geschikte crosslinker.
Homobifunctionele crosslinking reagentia hebben identieke reactieve groepen aan beide uiteinden en worden over het algemeen gebruikt bij het binden van soortgelijke functionele groepen. Deze reagentia worden hoofdzakelijk gebruikt om intramoleculaire crosslinks te vormen en kunnen worden gebruikt bij de bereiding van polymeren uit monomeren. Hoewel dit type reagentia een algemene momentopname van alle eiwitinteracties kan vastleggen, kunnen zij niet de nauwkeurigheid bieden die vereist is voor andere soorten crosslinking-toepassingen.
Enkele gangbare voorbeelden van amine-aan-amine crosslinkers zijn disuccinimidyl suberaat of DSS (ideaal voor receptor ligand cross-linking), disuccinimidyl tartraat of DST (gebruikt voor toepassingen waar crosslink splitsbaarheid vereist is terwijl de eiwit disulfide bindingen intact blijven) en dithiobis succinimidyl propionaat, of DSP (bij voorkeur gebruikt voor verknoping van intracellulaire eiwitten voorafgaand aan cellysis en immunoprecipitatie, alsmede voor het fixeren van eiwitinteracties voorafgaand aan de identificatie van zwakke of voorbijgaande eiwitinteracties). Enkele gangbare voorbeelden van sulfhydryl-naar-sulfhydryl crosslinkers zijn BMOE en DTME.
Heterobifunctionele crosslinking reagentia bezitten twee verschillende reactieve groepen en kunnen worden gebruikt om ongelijke functionele groepen te koppelen. Deze reagentia worden gebruikt om meervoudige intermoleculaire crosslinks en conjugaten te produceren met behulp van ongelijke biomoleculen. In tegenstelling tot homobifunctionele crosslinkers die slechts eenstapsconjugatie van moleculen mogelijk maken, maken heterobifunctionele crosslinkers tweestapsconjugatie mogelijk. Dit minimaliseert ongewenste polymerisatie of zelfconjugatie.
Photoreactieve crosslinking reagentia zijn heterobifunctionele crosslinkers die alleen reactief worden bij blootstelling aan ultraviolet of zichtbaar licht. Dit type crosslinking reagens wordt het best gebruikt voor niet-specifieke bioconjugatie en kan worden gebruikt om nucleïnezuren, eiwitten en andere moleculaire structuren te binden. Er zijn twee fotoreactieve chemische groepen die wereldwijd op grote schaal worden gebruikt in eiwitlaboratoria – aryl-aziden en diazirinen.
Aryl-aziden (N-((2-pyridyldithio)ethyl)-4-azidosalicylamide) zijn de meest gebruikte fotoreactieve reagentia in crosslinking-reacties. Bij blootstelling aan 250-350nm UV-licht kunnen deze reagentia de vorming van een nitreengroep vergemakkelijken die een additiereactie met de dubbele bindingen op gang kan brengen. Bovendien kunnen deze crosslinkers de productie van C-H insertieproducten op gang brengen of reageren met een nucleofiel. Enkele veelgebruikte crosslinking reagentia die tot deze groep behoren zijn ANB-NOS (N-5-Azido-2-nitrobenzyloxysuccinimide) en Sulfo-SANPAH.
Aan de andere kant bevatten NHS-ester diazirines of azipentanoaten een fotoactiveerbare diazirine ring en een N-hydroxysuccinimide (NHS) ester die efficiënt reageert met primaire aminogroepen in neutrale tot basische buffers (pH 7 tot 9) om stabiele amide bindingen te vormen. Het vertoont een betere fotostabiliteit in vergelijking met de fenylazidegroep en kan gemakkelijk worden geactiveerd met langgolvig ultraviolet licht (330 tot 370 nm) om carbeentussenproducten te produceren die covalente bindingen vormen met elke peptideruggengraat of aminozuurzijketens binnen de afstand van de afstandsarm.