Odczynniki sieciujące lub crosslinkery są używane do kowalencyjnego wiązania dwóch lub więcej cząsteczek białek w celu ułatwienia identyfikacji zależności między białkami znajdującymi się w bliskim sąsiedztwie, interakcji ligand-receptor, trójwymiarowych struktur białkowych i związków molekularnych w błonach komórkowych. W ten sam sposób mogą być one również stosowane do modyfikacji kwasów nukleinowych, leków i powierzchni stałych oraz w przygotowywaniu koniugatów przeciwciało-enzym i immunotoksyn.
Jak te odczynniki mogą to wszystko zrobić? To proste. Odczynniki do sieciowania białek zawierają zazwyczaj dwie lub więcej chemicznie reaktywnych grup, które łączą się z grupami funkcyjnymi (np. aminami pierwszorzędowymi, sulfhydrylami, karbonylami, węglowodanami i kwasami karboksylowymi) znajdującymi się w białkach i innych cząsteczkach. Reakcje te sprawiają, że cząsteczki są wystarczająco stabilne, aby umożliwić intensywną analizę naukową.
Typy odczynników sieciujących
Istnieją trzy różne typy odczynników sieciujących – odczynniki sieciujące homobifunkcyjne, heterobifunkcyjne i fotoreaktywne. Czym różnią się między sobą te typy odczynników sieciujących i skąd wiadomo, którego z nich użyć do konkretnego zastosowania? Oto kilka rzeczy, które należy rozważyć przy wyborze odpowiedniego środka sieciującego.
Homobifunkcyjne odczynniki sieciujące mają identyczne grupy reaktywne na obu końcach i są ogólnie stosowane do wiązania podobnych grup funkcyjnych. Odczynniki te są głównie używane do tworzenia wewnątrzcząsteczkowych wiązań krzyżowych i mogą być stosowane w przygotowywaniu polimerów z monomerów. Podczas gdy ten typ odczynników może uchwycić ogólny obraz wszystkich interakcji białkowych, nie mogą one zapewnić dokładności wymaganej dla innych typów zastosowań sieciowania.
Kilka typowych przykładów aminowo-aminowych środków sieciujących obejmuje suberat disuccinimidylowy lub DSS (idealny do sieciowania ligandów receptorowych), winian disuccinimidylowy lub DST (stosowany do zastosowań, w których wymagana jest zdolność do rozszczepiania wiązań krzyżowych przy jednoczesnym utrzymaniu nienaruszonych białkowych wiązań disiarczkowych) i propionian ditiobis sukcynimidylu, lub DSP (idealnie używany do sieciowania białek wewnątrzkomórkowych przed lizą komórek i immunoprecypitacją, jak również do utrwalania interakcji białkowych przed identyfikacją słabych lub przejściowych interakcji białkowych). Niektóre powszechne przykłady sulfhydrylo-sulfhydrylowych odczynników sieciujących obejmują BMOE i DTME.
Heterobifunkcyjne odczynniki sieciujące posiadają dwie różne grupy reaktywne i mogą być stosowane do łączenia niepodobnych grup funkcjonalnych. Odczynniki te są stosowane do wytwarzania wielu międzycząsteczkowych wiązań krzyżowych i koniugatów przy użyciu niepodobnych biomolekuł. W przeciwieństwie do homofunkcyjnych środków sieciujących, które jedynie ułatwiają jednoetapowe łączenie cząsteczek, heterofunkcyjne środki sieciujące pozwalają na dwuetapowe łączenie. Minimalizuje to niepożądaną polimeryzację lub samo-koniugację.
Fotoreaktywne odczynniki sieciujące to heterobifunkcyjne środki sieciujące, które stają się reaktywne tylko po wystawieniu na działanie światła ultrafioletowego lub widzialnego. Ten typ odczynnika sieciującego jest najlepiej wykorzystywany do niespecyficznej biokoniugacji i może być stosowany do wiązania kwasów nukleinowych, białek i innych struktur molekularnych. Istnieją dwie fotoreaktywne grupy chemiczne, które są szeroko stosowane w laboratoriach białkowych na całym świecie – aryloazydy i diaziryny.
Azydy arylowe (N-((2-pyridyldithio)ethyl)-4-azidosalicylamid) są najczęściej stosowanymi odczynnikami fotoreaktywnymi w reakcjach sieciowania. Po naświetleniu światłem UV o długości fali 250-350nm odczynniki te ułatwiają tworzenie się grupy nitrenowej, która może wywołać reakcję addycji z wiązaniami podwójnymi. Ponadto, odczynniki te mogą inicjować wytwarzanie produktów insercji C-H lub reagować z nukleofilem. Niektóre popularne odczynniki sieciujące należące do tej grupy obejmują ANB-NOS (N-5-azido-2-nitrobenzyloxysuccinimide) i Sulfo-SANPAH.
Z drugiej strony, NHS-estry diaziryn lub azipentanianów zawierają fotoaktywny pierścień diaziryny i ester N-hydroksysuccinimidu (NHS), który skutecznie reaguje z pierwszorzędowymi grupami aminowymi w buforach obojętnych do zasadowych (pH 7 do 9) tworząc stabilne wiązania amidowe. Wykazuje lepszą fotostabilność w porównaniu z grupą azydkową fenylu i może być łatwo aktywowany długofalowym światłem ultrafioletowym (330 do 370nm) w celu wytworzenia karbenowych produktów pośrednich, które tworzą wiązania kowalencyjne z dowolnymi szkieletami peptydowymi lub łańcuchami bocznymi aminokwasów w obrębie ramienia dystansowego.
.