Reagentes de Crosslinking ou reticuladores são usados para ligar covalentemente duas ou mais moléculas proteicas para facilitar a identificação de relações entre proteínas de vizinho próximo, interações liga-receptor, estruturas protéicas tridimensionais e associações moleculares nas membranas celulares. Da mesma forma, elas também podem ser usadas para modificar ácidos nucléicos, drogas e superfícies sólidas, e na preparação de conjugados anti-corpo-enzimáticos e imunotoxinas.
Como estes reagentes podem fazer tudo isto? Simples. Reagentes de ligação cruzada de proteínas normalmente contêm dois ou mais grupos quimicamente reactivos que se ligarão aos grupos funcionais (por exemplo, aminas primárias, sulfhydryls, carbonyls, carbohidratos e ácidos carboxílicos) encontrados em proteínas e outras moléculas. Estas reações fazem as moléculas estáveis o suficiente para permitir análise científica intensiva.
Tipos de Reagentes de Cruzamento
Há três tipos diferentes de reticuladores – reagentes de cruzamento homobifuncionais, heterobifuncionais, e fotorreativos. Como estes tipos de reticuladores diferem uns dos outros e como você sabe qual deles usar para sua aplicação específica? Aqui estão algumas coisas que você pode precisar considerar ao escolher um crosslinker adequado.
Reagentes de reticulação homobifuncionais têm grupos reativos idênticos em ambas as extremidades e são geralmente usados em ligação como grupos funcionais. Estes reagentes são usados principalmente para formar ligações cruzadas intramoleculares e podem ser usados na preparação de polímeros a partir de monómeros. Embora este tipo de reagentes possa captar um instantâneo geral de todas as interacções proteicas, eles não podem fornecer a precisão necessária para outros tipos de aplicações de reticulação.
Alguns exemplos comuns de reticuladores amina a amina incluem o suberato de disuccinimidil ou DSS (ideal para reticulação de ligante receptor), tartarato de disuccinimidil ou DST (usado para aplicações onde a clivagem de reticulação é necessária mantendo intactas as ligações de dissulfeto propionato de ditiobis succinimidil, ou DSP (ideal para reticulação de proteínas intracelulares antes da lise celular e imunoprecipitação, bem como para fixação de interações proteicas antes da identificação de interações proteicas fracas ou transitórias). Alguns exemplos comuns de reticuladores sulfidrílicos a sulfidrílicos incluem BMOE e DTME.
Reagentes de reticulação cruzada heterobifuncionais possuem dois grupos reativos diferentes e podem ser usados para ligar grupos funcionais diferentes. Estes reagentes são usados para produzir múltiplas ligações cruzadas intermoleculares e conjugadas usando biomoléculas dissimilares. Ao contrário dos reticuladores homobifuncionais que meramente facilitam a conjugação de moléculas em um único passo, os reticuladores heterobifuncionais permitem conjugações de dois estágios. Isso minimiza a polimerização indesejável ou autoconjugação.
Reagentes reticulantes fotorreativos são reticulantes heterobifuncionais que se tornam reativos somente após exposição à luz ultravioleta ou visível. Este tipo de reagente reticulado é melhor usado para bioconjugação não específica e pode ser usado para ligar ácidos nucleicos, proteínas e outras estruturas moleculares. Existem dois grupos químicos fotorreativos que estão sendo amplamente utilizados em laboratórios de proteínas em todo o mundo – aril-azidas e diazirinas.
Aryl azides (N-((2-piridilditio)etil)-4-azidosalicilamida) são os reagentes fotorreativos mais amplamente utilizados em reações de reticulação. Quando expostos à luz UV de 250-350 nm, estes reagentes podem facilitar a formação de um grupo de nitrogénio que pode desencadear uma reacção de adição com as ligações duplas. Além disso, estes reticuladores podem iniciar a produção de produtos de inserção de C-H ou reagir com um nucleófilo. Alguns reagentes reticulantes comuns que pertencem a este grupo incluem ANB-NOS (N-5-Azido-2-nitrobenziloxissuccinimida) e Sulfo-SANPAH.
Por outro lado, as diazirinas ou azipentanoatos NHS-ester contêm um anel de diazirina fotoactivável e um éster de N-hidroxissuccinimida (NHS) que reage eficientemente com grupos de amino primários em tampões básicos (pH 7 a 9) para formar ligações amidas estáveis. Ele exibe melhor fotoestabilidade em comparação com o grupo da azida fenil e pode ser facilmente ativado com luz ultravioleta de onda longa (330 a 370nm) para produzir intermediários de carbeno que formam ligações covalentes com qualquer espinha dorsal de peptídeo ou cadeias laterais de aminoácidos dentro da distância do braço espaçador.