Alai

Mekaniken hos stavformade tunna skal

Stavformad tillväxt kräver i slutändan att symmetrin bryts, vilket kan bero på riktningar i cellväggens materialegenskaper, på spänningar, på organiseringen av syntesmaskineriet eller på någon kombination av dessa. Fysiska modeller för morfogenes av celler med väggar betraktar cellen som ett tunt viskoelastiskt skal som är enhetligt uppblåst inifrån genom turgatryck. För att förutsäga den cellform som blir resultatet av en viss tillväxtmekanism är det viktigt att ta hänsyn till fördelningen av de krafter som beror på turgortrycket, de motverkande krafterna från väggens sträckning och hur väggens materialegenskaper kopplar ihop dessa krafter med graden av utbredning. För ett linjärt elastiskt material är spänningen σ (kraft per ytenhet) relaterad till den mekaniska töjningen ε (fraktionell sträckning) via Youngs modul:

ett mått på materialets inneboende styvhet som liknar kraftkonstanten k för en fjäder (för vilken Hookes lag föreskriver att k = F/x, där F är den kraft som krävs för att sträcka ut fjädern med en mängd x). I ett elastiskt tunt skal bör spänningarna öka med ökande cellradie r och med turgatrycket P, och minska med större cellväggstjocklek d. I ett sfäriskt skal är spänningarna lika stora i alla riktningar. Däremot dikterar geometrin hos ett cylindriskt skal att spänningarna i omkretsen (σ r ) är dubbelt så stora som spänningarna i längsled (σ l ) (figur 1c):

Kombinerar man ekvationerna 1 och 2, förutsäger dessa modellrelationer att de cirkumferentiella och longitudinella spänningarna (ε r respektive ε l ) bör vara linjärt beroende av bredd och turgortryck och omvänt beroende av väggtjockleken. Om Youngs modul är lika i alla riktningar (mekaniskt isotropisk) bör ε r vara dubbelt så stor som ε l .

Detta förhållande mellan spänningarna i olika riktningar har använts för att undersöka de mekaniska egenskaperna hos cellväggen i stavformade celler. I fissionsjäst avslöjar mätning av graden av krympning av cellerna när turgortrycket minskas detta förutspådda 2:1-förhållande mellan deformationer, vilket tyder på att cellväggen i dessa celler beter sig som ett isotropt material (Atilgan och Chang, opublicerade observationer). I stavformade bakterier som E. coli och B. subtilis uppvisar cellerna däremot en högre grad av longitudinell snarare än radiell sträckning , vilket tyder på mekanisk anisotropi (eller riktningsberoende), med större styvhet i den cirkumferentiella riktningen i förhållande till den longitudinella riktningen . Dessa observationer stämmer överens med kryoelektrontomogram som visar att E. coli-cellväggen är organiserad med de styvare komponenterna (glykansträngar) orienterade längs den cirkumferentiella riktningen . Det blir intressant att ta reda på om det finns mekanisk anisotropi i växternas cellväggar, eller om de mer liknar cellväggen hos fissionsjäst.

Det är viktigt att notera att tillväxtens anisotropi (förlängning längs endast en axel) kan ske med hjälp av antingen anisotropt eller isotropt väggmaterial; i själva verket kan isotropt material användas för att konstruera i stort sett vilken cellform som helst. Dessutom kan cellväggens mekaniska egenskaper vara mycket mer komplexa än de enkla skalförhållanden som vi har beskrivit ovan. Nyligen utförda mätningar med atomkraftmikroskopi tyder på att E. coli-cellväggen uppvisar icke-linjära egenskaper i sitt trycksatta tillstånd, vilket kan hjälpa cellen att motstå expansion under hypoosmotisk chock . Antagandet om en konstant tjocklek över det tunna skalet kan också brytas ner, särskilt under septum på grund av skillnader i väggens uppbyggnad vid septum . I slutändan måste dessa mekaniska egenskaper integreras med mönstren för insättning och ombyggnad av väggen, vilket både kan förändra cellväggens tjocklek och leda till en viskoelastisk reaktion där väggmaterialet flyter som en viskös vätska när det utsätts för påfrestningar. Detta ger upphov till en mängd olika potentiella tillväxtmekanismer i celler med väggar. Biofysikaliska modeller kan ge testbara förutsägelser för sambanden mellan turgatryck, tillväxtmönster och fördelningen av stammar och tillväxthastighet över cellytan ,.

Växt genom cylindrisk förlängning

I många bakterier uppnås celltillväxt genom att nytt cellväggsmaterial sätts in på ställen i hela den cylindriska delen av cellväggen, medan insättningen minskar vid cellpolerna. Den mest välstuderade organismen ur perspektivet cellväggstillväxt är E. coli, med flera översikter som fokuserar på cellväggens biokemi , syntesmaskineri , morfologi , och fysiska egenskaper. Liksom de flesta bakterier har E. coli en cellvägg som består av peptidoglykan, ett makromolekylärt nätverk av sockersträngar (glykaner) som är tvärbundna med korta peptider. Som nämnts ovan är de styvare glykansträngarna orienterade i omkrets, vilket gör cellväggen mekaniskt anisotrop utöver stavformens tillväxtanisotropi. Cytoskelettproteinet MreB, en homolog till eukaryot aktin , rör sig ungefär i omkrets längs cytoplasmimembranets insida, och det cellväggsinriktade antibiotikumet mecillinam hämmar denna rörelse, vilket tyder på en modell där MreB-spåren anger banorna för insättning av nytt material på sidoväggen ,. Dessutom vrider sig E. coli-cellerna när de förlängs på ett MreB-beroende sätt, på grund av att glykansträngarna är orienterade med en liten vinkelbias bort från omkretsriktningen . I B. subtilis har man observerat en liknande koppling av MreB:s rörelse till syntesen av cellväggen och vridning (med motsatt riktning), vilket tyder på gemensamma regler med E. coli för att skapa ordning i väggen trots skillnaden i väggtjocklek. Det är okänt om det MreB-styrda mönstret för cellväggens insättning också hjälper cellen att bestämma och/eller bibehålla sin bredd under tillväxten, även om mutationer i mreB kan resultera i stavar av olika storlekar .

En förutspådd konsekvens av cylindrisk förlängning är exponentiell tillväxt, där enskilda långa celler växer snabbare än korta celler. E. coli-celler förlängs faktiskt exponentiellt när delningen blockeras , och verkar göra det även under normal tillväxt och delning . Intressant nog dikterar den exponentiella tillväxtens natur (L = L02t/τ, där τ är fördubblingstiden) att 1/L (dL/dt) = (ln 2)/τ är konstant oberoende av L, vilket tyder på att det inte finns någon föredragen längdskala för en given fördubblingstid.

E. coli har tillsammans med den böjda bakterien Caulobacter crescentus varit ett huvudämne för teoretiska och beräkningsmässiga studier av bakteriell morfogenes. Modellerna har fallit in i två breda, kompletterande klasser: grovkorniga molekyldynamiska simuleringar av väggmekanik och tillväxt, motiverade av antagna mekanismer för molekylär samordning och/eller experimentella mätningar av mönster för insättning av cellväggar ,,; och finita-elementmekanokemiska modeller som införlivar väggremodellering med mekanisk avslappning för att förutsäga potentiella instabiliteter och skalförhållanden mellan celldimensioner och tillväxtparametrar ,-. En modell som tar hänsyn till balansen mellan den kemiska energi som frigörs under införandet och förändringen av spänningsenergin på grund av den nya geometrin efter tillväxten förutsäger en stabil bredd och tillväxthastighet för stavformad tillväxt som stämmer överens med mätningar av E. coli och B. subtilis för rimliga val av parametrar . Simuleringar baserade på denna modell tyder på att MreB utövar en inåtriktad kraft på cellväggen, vilket förhindrar instabiliteter i tillväxten på grund av turgatryck . Beräkningsmodeller har i allmänhet föreslagit att robust formbestämning kräver samordning av införlivandet av cellväggen , och simuleringar på molekylär skala tyder på att MreB:s rörelse kan bidra till att bibehålla cellbredden längs cellkroppen, särskilt under störningar som osmotisk chock .

Växt genom förlängning av cellspetsar

I motsats till E. coli växer vissa stavformade celler genom att ny cellvägg och nytt membran sätts in i cellspetsarna, medan sidoväggen är relativt trög. Mekanismerna för spetstillväxt har undersökts i många organismer med väggar, inklusive S. pombe, hyfala svampar, mossa och pollenrör, samt i bakterier som A. tumefaciens. I allmänhet anses spetstillväxt drivas av ett högt turgatryck som förlänger cellväggen vid spetsen, kopplat till tillförsel av nytt material och ombyggnad av gammalt material genom en mängd olika intracellulära faktorer (figur 1b).

Fysiska modeller för spetstillväxt har postulerat att en stavliknande form bildas genom att en mjukare gelliknande vägg förs in i cellens yttersta spets, som sedan mognar till ett styvare nätverk på sidorna av cellerna ,-. Morfogenetiska parametrar som definierar cellspetsens form hänger sedan samman genom balansen mellan mognad, tryck och införande, med massbevarande som begränsning. Vissa generaliserade biofysikaliska modeller för spetstillväxt har abstraherats bortom de molekylära detaljerna och strukturen hos ett visst system och har därför varit användbara för att tillhandahålla skallagar som relaterar spetsform, cellstorlek och tillväxthastighet och som kan testas och valideras med hjälp av jämförande studier mellan olika arter (figur 2) . I en nyligen genomförd studie förutspås den maximala spetsens krökningsradie R A skala som 1/P medan cellradien förutspås skala som (a2/P)1/3, där a är storleken på det område där nytt material utsöndras. Detta ger ett förhållande mellan de två storheterna:

där R och R A lätt kan mätas från bilder av celler. I denna modell antas väggviskositeten vara en fast funktion av vinkeln runt cellspetsen, oberoende av andra parametrar; det återstår att se hur känsliga förutsägelserna är för detta antagande. Det är dock intressant att olika arter av svampar och växtpollenrör alla uppvisar ett linjärt förhållande mellan R och R A (R A /R konstant). Om ekvation 3 stämmer innebär dessa data att storleken a på insättningszonen också skalar med R, och närbesläktade arter har till och med liknande lutningar. I överensstämmelse med dessa modeller, i pollenrör och i S. pombe, är cellväggssyntaserna lokaliserade till växande cellspetsar där de introducerar nytt väggmaterial. I pollenrör har mätningar med atomkraftmikroskopi avslöjat en gradient av cellväggens styvhet, där väggen vid spetsen är mjukast. Även om sådana mätningar inte har gjorts i fissionsjäst tyder väggfärgningar som kalcofluorvitt också på en gradient av cellväggens styvhet ,,. Dessutom stämmer mönster för migrationen av referensmarkörer längs cellen under tillväxten överens med mekaniska modeller för expansionen av en halvkula till en cylinder , vilket illustrerar användbarheten av avbildning av dynamiska tillväxtmönster för att undersöka morfogenetiska mekanismer ,,.

I S. pombe har komplexa molekylära nätverk identifierats som modulerar cellformen, och som därför kan vara involverade på någon nivå i regleringen av cellväggsmaskineriet. Viktiga centrala cellprocesser omfattar exocytos, endocytos, aktin- och mikrotubulcytoskelett och små GTPaser som Rho och Cdc42 (se för en översikt). Cdc42 kan reglera aktin- och membrantrafiken för att rikta sekretoriska vesiklar som innehåller cellväggssyntaser, cellväggsprekursorer och membran till tillväxtplatsen (figur 1b) . Även om både aktin och mikrotubuli antas utöva krafter som pressar och förvränger plasmamembranet i djurceller, finns det få bevis för att de formar celler med väggar genom att direkt utöva krafter . I stället spelar aktin minst två kritiska roller i polariserad celltillväxt: som spår för myosinbaserad transport av vesiklar till cellspetsen och för endocytos . Mikrotubuli har en direkt roll i polariserad transport av vesiklar hos vissa svampar, t.ex. Aspergillus och Ustilago, . I S. pombe spelar mikrotubuli en reglerande roll för polariteten genom att deponera teproteiner som reglerar aktin och Cdc42 vid cellspetsarna , och kan styra bildandet av en gren under vissa omständigheter ,. Matematiska modeller har utforskat hur Tea-proteinerna fungerar som landmärken för att etablera gradienter av aktiverad Cdc42 ,. Intressant nog har Cdc42-aktiviteten observerats oscillera mellan de två cellspetsarna med en tidsskala på cirka fem minuter, vilket kan modelleras med hjälp av positiva och negativa återkopplingsslingor . Det är inte känt om tillväxten hos fissionsjäst varierar med dessa Cdc42-svängningar, även om pollenrör och vissa hyfala svampar uppvisar topptillväxt i oscillerande pulser . Dessutom uppvisar vissa mutanter med förändrad Cdc42-aktivitet förändrade cellbredder, vilket tyder på en modell där en gradient av Cdc42-aktivitet vid cellspetsarna används för att specificera stavens bredd ,,,. Hur rumsliga mönster av polaritetsfaktorer som Cdc42 kontrollerar cellformen genom cellväggstillväxt är fortfarande dåligt förstått.

Dimensionerna hos stavar

Cellulära dimensioner som bredd, längd och cellväggstjocklek varierar kraftigt mellan olika organismer, vilket potentiellt påverkar fördelningen av spänningar och därmed den resulterande cellformen . Därför kommer kvantifiering av fördelningen av dessa celldimensioner, tillsammans med morfologiska egenskaper som cellkroppens och spetsens krökningsprofil, att vara avgörande för att studera och kontrastera tillväxtmekanismer . På senare tid har beräkningsverktyg utvecklats som möjliggör snabb, automatiserad analys av stora cellpopulationer med subpixelupplösning . För att illustrera variationen i absoluta cellstorlekar bland bakterie- och svamparter avbildade vi celler och analyserade deras former med hjälp av en gemensam Matlab-baserad beräkningsram som tidigare tillämpats för kvantifiering av cellbredd i bakterier (Figur 3a) . Dessa mätningar gjorde det också möjligt för oss att mäta cellkonturens krökning; vi noterade att i avsmalnande celler (till exempel Schizosaccharomyces japonicus) förblev sidorna raka medan polerna hade olika krökning (figur 3b). Aspektförhållandet är ungefär bevarat bland de studerade bakterierna och i S. pombe, även om andra svampar som S. japonicus är något mer squat i aspektförhållandet.

Kvantitativa mätningar av turgatryck och cellväggsegenskaper är också avgörande för att förstå mekanismerna för bestämning av cellform. Även om turgatrycket har mätts direkt i stora växtceller , har de mindre storlekarna hos bakterier och jäst gjort det nödvändigt att utveckla indirekta metoder för att uppskatta turgatrycket ,,,,. Organismer med väggar tycks växa under ett turgatryck på några få till tiotals atmosfärer ,. Eftersom de måste tåla dessa turgorspänningar har deras väggar Young-moduler på tiotals till hundratals MPa (1 atm = 0,1 MPa) , och kan potentiellt stelna vid påfrestningar . E. coli-cellväggen har en Young-modul på 25-100 MPa , och cellerna utsätts för ett turgortryck på ungefär 1 atm . Intressant nog har B. subtilis-cellerna ett turgatryck som är ungefär 10 gånger högre än E. coli-cellerna, och deras väggar har en liknande elasticitetsmodul men är 10 gånger tjockare , vilket tyder på att deras liknande former kanske kan uppstå på grund av en gemensam mekanisk balans mellan turgatryck och väggspänningar . Nya uppskattningar av S. pombe-celler placerar Young-modulen vid cirka 50 MPa och turgortrycket vid 10 till 15 atm (våra opublicerade data).

Hur den absoluta cellstorleken specificeras är okänt i någon celltyp, och förblir en av de olösta frågorna inom morfogenesen. Hur specificerar cellerna sina dimensioner, och hur är en viss storlek (liksom cellform) fördelaktig i evolutionärt hänseende? Det är uppenbart att många celler noggrant upprätthåller sin storlek när de växer och delar sig med hjälp av homeostatiska mekanismer ,. Vissa celler påbörjar till exempel delning eller DNA-replikation först när de har uppnått en minimal cellstorlek, vilket tyder på att de har förmågan att känna av sin egen storlek eller geometri. S. pombe-celler växer till 14 μm i längd innan de går in i mitos och delar sig. Nya framsteg har identifierat ett system av kortikala faktorer, inklusive Cdr2 och Pom1, som verkar övervaka cellens yta i denna process . Liknande system har föreslagits i bakterier . Ytterligare faktorer som påverkar cellstorleken är mekaniska överväganden, t.ex. cellväggsspänning och turgatryck. För en bakterie i mikrometerstorlek skulle en ökning av cellbredden vara kopplad till en ökning av spänningen som skulle medföra en ökad sträckning av väggen. Om inte cellväggens mekaniska egenskaper eller tjocklek justerades skulle en bakterie troligen inte kunna expandera för att nå storleken på en S. pombe-cell utan att spricka. Det blir intressant att fastställa hur de mekaniska egenskaperna och väggens tjocklek varierar mellan närbesläktade arter av olika storlek, t.ex. Bacillus megaterium (som är ungefär 1,5 μm bred) eller den större fissionsjästen S. japonicus (figur 3a). Varje art kan alltså uppnå en viss storlek som passar dess mekaniska egenskaper och tillväxtegenskaper.

Formning av en stav från en sfär

Förutom fortplantning av formen under tillväxten kan celler stå inför utmaningen att initialt etablera formen. Flera system har upprättats för att undersöka bildandet av stavformen de novo. När S. pombe-sporer gror sväller de i allmänhet upp till en nästan sfärisk form och odlar sedan en utskjutande del som så småningom sträcker sig till en stav med rätt bredd. Mekanisk anisotropi som orsakas av ett brott i sporväggen och en lokal ackumulering av Cdc42-aktivitet kan utlösa den inledande tillväxten av utskjutningen. Man vet dock inte mycket om hur den utskjutande stavens dimensioner och form etableras. Ett annat exempel på de novo formbildning är vid regenerering av sfäroplaster. När cellväggen avlägsnas är den resulterande S. pombe-spheroplasten sfärisk; när väggen regenereras sträcker sig en stav med rätt bredd från den större runda cellen i den första generationen . Bakterier kan också regenerera sig till stavar. I motsats till jäst övergår bakteriella sfäroplaster från amorfa former till att bilda väggar, stavformade celler under loppet av några generationer , och det har nyligen visats att denna återgång till stavform hos B. subtilis kan inledas från ett helt vägglöst tillstånd . Dessa beteenden visar att cellens form och dimensioner regleras av robusta intracellulära mekanismer och inte enbart beror på formen hos cellerna i tidigare generationer.

Hålla bredd och hålla stången rak

En utmaning för stavformade celler är att bibehålla cellbredden under tillväxten. För de stavformade bakterierna E. coli och B. subtilis, som båda förlängs längs den cylindriska delen av cellen , förblir cellbredden konstant även i trådformade celler som växer till längder som närmar sig 100 mikrometer ,. Liknande bibehållande av bredden ses i S. pombe- och i växternas pollenrör. I spetstillväxande stavar måste spetsens tillväxtzon förbli konstant. I bakterier som E. coli måste tillväxten samordnas med utvidgningen så att bredden bibehålls när cellens längd ökar. Modelleringsstudier har förutsagt att det är nödvändigt att införa stress i det nya materialet under inkorporeringen för att förhindra turgormedierad radiell expansion ,,; depolymerisering av MreB orsakar en gradvis ökning av cellbredden , vilket tyder på att MreB kan spela en roll i införandet av denna stress. Avgörande för att testa dessa modeller kommer att vara utvecklingen av genetiska och kemiska metoder för att ställa in cellbredden utan att störa den övergripande stavformade formen.

En annan utmaning för stavformade celler är att bibehålla en linjär tillväxtaxel under förlängningen. Hur kan en cell övervaka ”rakheten”? I E. coli-celler lokaliseras det aktinliknande MreB-cytoskelettet företrädesvis till områden med negativ gaussisk krökning, vilket tyder på att MreB-polymerer känner av cellens krökning och aktivt rätar ut cellen genom att styra cellväggens insättning till specifika platser på cellytan baserat på den lokala geometrin . I S. pombe kan cytoskelettet av mikrotubuli hålla cellerna raka genom att samordna cellväggstillväxten vid cellspetsarna. Mikrotubuli sträcker sig över cellens längd och transporterar polaritetsfaktorer, t.ex. teaproteinerna, till spetsarna . Mutanter med onormalt korta mikrotubuli eller som saknar Tea-proteiner växer ofta i en böjd form eller etablerar ibland en onormal tillväxtzon på sidan av cellen, vilket leder till bildandet av en förgrenad, T-formad fenotyp , vilket tyder på att mikrotubuli bidrar till rakheten genom att samordna de rätta tillväxtzonerna vid de två cellspetsarna ,. Sammantaget är cytoskelettet i både prokaryoter och eukaryoter åtminstone delvis ansvarigt för att upprätthålla cellformen genom att samordna lokala tillväxtmönster med den globala morfologin .

Nybildning av ändar: en mekanisk mekanism

Endarna av många stavformade celler är ungefär halvklotformade, med dimensioner som överensstämmer med de cylindriska delarna av cellen. Medan den växande änden av en spetsväxande cell regleras av många intracellulära faktorer som modulerar den progressiva ombyggnaden av cellväggen, ger bildandet av den nya celländen i S. pombe ett exempel på hur turgatrycket i sig självt kan forma cellväggen. Under cytokinesis bildas en cellväggsskiljevägg vid delningsstället, styrd av den aktinbaserade kontraktila ringen. Därefter smälts en del av septumet bort för att orsaka celldelning ; omedelbart efter delningen förändras septumet från en platt form till den avrundade nya änden. Denna morfologi, som skiljer sig från den växande cellspetsens något mer spetsiga form, kan produceras av en huvudsakligen mekanisk mekanism där turgatrycket blåser upp cellväggen (våra opublicerade observationer). Det blir intressant att se om några Gram-positiva bakterier, som har en tjockare cellvägg än Gram-negativa och som bildar ett septum ungefär som i S. pombe, också formar sina nya ändar på ett turgormedierat sätt. Däremot drar E. coli-cellerna ihop sig i mitten av cellen långt före celldelningen . Denna sammandragning förmedlas av tubulinhomologen FtsZ , i kombination med en progressiv omformning av cellväggen för att skapa en halvklotformig polär morfologi.