Tvärbindningsreagenser eller tvärbindare används för att kovalent binda två eller flera proteinmolekyler för att underlätta identifieringen av relationer mellan närliggande proteiner, ligand-receptorinteraktioner, tredimensionella proteinstrukturer och molekylära föreningar i cellmembraner. På samma sätt kan de också användas för att modifiera nukleinsyror, läkemedel och fasta ytor samt vid framställning av antikropp-enzymkonjugat och immuntoxiner.
Hur kan dessa reagenser göra allt detta? Enkelt. Reagens för tvärbindning av proteiner innehåller vanligtvis två eller flera kemiskt reaktiva grupper som ansluter sig till de funktionella grupper (t.ex. primära aminer, sulfhydryls, karbonyls, kolhydrater och karboxylsyror) som finns i proteiner och andra molekyler. Dessa reaktioner gör molekylerna tillräckligt stabila för att möjliggöra intensiva vetenskapliga analyser.
Typer av tvärbindningsreagenser
Det finns tre olika typer av tvärbindare – homobifunktionella, heterobifunktionella och fotoreaktiva tvärbindningsreagenser. Hur skiljer sig dessa typer av tvärbindare från varandra och hur vet du vilken du ska använda för din specifika tillämpning? Här är några saker som du kan behöva tänka på när du väljer en lämplig tvärbindare.
Homobifunktionella tvärbindningsreagenser har identiska reaktiva grupper i båda ändarna och används i allmänhet för att binda liknande funktionella grupper. Dessa reagenser används huvudsakligen för att bilda intramolekylära tvärbindningar och kan användas vid framställning av polymerer från monomerer. Även om denna typ av reagenser kan ge en allmän ögonblicksbild av alla proteininteraktioner kan de inte ge den noggrannhet som krävs för andra typer av tvärbindningstillämpningar.
Några vanliga exempel på amin-till-amin-korslänkare är disuccinimidylsuberat eller DSS (idealiskt för korslänkning av receptorligander), disuccinimidyltartrat eller DST (används för tillämpningar där korslänkarens klyvbarhet krävs samtidigt som proteindisulfidbindningarna hålls intakta) och dithiobis succinimidylpropionat, eller DSP (används idealiskt för tvärbindning av intracellulära proteiner före celllys och immunoprecipitering samt för fixering av proteininteraktioner före identifiering av svaga eller övergående proteininteraktioner). Några vanliga exempel på sulfhydryl-till-sulfhydryl-korslänkare är BMOE och DTME.
Heterobifunktionella korslänkningsreagenser har två olika reaktiva grupper och kan användas för att länka olika funktionella grupper. Dessa reagenser används för att framställa flera intermolekylära tvärbindningar och konjugat med hjälp av olikartade biomolekyler. Till skillnad från homobifunktionella tvärbindare som endast underlättar konjugering av molekyler i ett enda steg, möjliggör heterobifunktionella tvärbindare konjugering i två steg. Detta minimerar oönskad polymerisering eller självkonjugering.
Fotoreaktiva tvärbindningsreagenser är heterobifunktionella tvärbindare som blir reaktiva endast vid exponering för ultraviolett eller synligt ljus. Denna typ av tvärbindningsreagens används bäst för icke-specifik biokonjugering och kan användas för att binda nukleinsyror, proteiner och andra molekylära strukturer. Det finns två fotoreaktiva kemiska grupper som används i stor utsträckning i proteinlaboratorier världen över – arylazider och diaziriner.
Arylazider (N-((2-pyridyldithio)etyl)-4-azidosalicylamid) är de mest använda fotoreaktiva reagenserna i tvärbindningsreaktioner. Vid exponering för 250-350 nm UV-ljus kan dessa reagenser underlätta bildandet av en nitrengrupp som kan utlösa en additionsreaktion med dubbelbindningarna. Dessutom kan dessa tvärbindare initiera bildandet av C-H-insättningsprodukter eller reagera med en nukleofil. Några vanliga tvärbindningsreagenser som tillhör denna grupp är ANB-NOS (N-5-Azido-2-nitrobenzyloxysuccinimid) och Sulfo-SANPAH.
Å andra sidan innehåller NHS-esterdiaziriner eller azipentanoater en fotoaktiverbar diazirinring och en N-hydroxysuccinimid (NHS)-ester som effektivt reagerar med primära aminogrupper i neutrala till basiska buffertar (pH 7-9) för att bilda stabila amidbindningar. Den uppvisar bättre fotostabilitet jämfört med fenylazidgruppen och kan lätt aktiveras med långvågigt ultraviolett ljus (330-370 nm) för att producera karbenintermediärer som bildar kovalenta bindningar med eventuella peptidryggkärnor eller aminosyrans sidokedjor inom spacerarmavståndet.